北清聯手Nat Methods：超平整石墨烯制備均勻的薄冰用于高分辨率冷凍電鏡結構分析

一、 【導讀】?

冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）已經成為結構生物學領域不可或缺的工具。隨著cryo-EM結構解析分辨率的不斷提高，制備均勻薄冰成為實現高分辨率結構測定的關鍵步驟，尤其是對于分子量小于100 kDa的生物大分子，由于其信噪比較低，高分辨重構非常困難。為了降低背景噪音，高分辨率結構測定需要制備較薄冰層。然而，在cryo-EM樣品制備中，冰層的厚度均勻性控制不佳，是高分辨率cryo-EM成像的主要挑戰之一。

二、【成果掠影】

北京大學彭海琳、韋小丁，清華大學王宏偉及劉楠等聯合發現樣品支持膜的平整度對薄冰層的均勻性有影響，并提出了一種使用超平石墨烯（UFG）作為cryo-EM樣品制備支撐膜的方法，以實現更好的玻璃態冰厚度的控制。他們使用UFG制備的均勻薄冰提高了冷凍樣品的成像質量，成功地測定了三個分子量較小的生物樣品，血紅蛋白、α胎蛋白和鏈霉親和素的三維結構，分辨率分別達到3.5 ?，2.6 ?和2.2 ?。相關成果以“Uniform thin ice on ultraflat graphene for high-resolution cryo-EM”發表在Nature Methods上。

?三、【核心創新點】

在本文中，作者提出了一種無褶皺的預拉伸超平整石墨烯（UFG）作為均勻薄冰制備的支撐膜。UFG的平整表面使得樣品中的目標顆粒能夠吸附到其表面上，處于同一平面，從而將它們與空氣-水界面隔離開來，并且保證了薄冰的均勻性。

?四、【數據概覽】

圖1：石墨烯的粗糙度影響了冰厚度的均勻性。? 2022 The Authors

a.示意圖顯示，有皺褶不平整的石墨烯會導致波浪形的冰層。冰層厚度不一致，這可能導致顆粒分布產生10-20納米的高度差異（ΔH）。在對傾轉樣品成像時，蛋白質顆粒信號被有皺褶的石墨烯所遮擋。b. 示意圖顯示，超平整石墨烯（UFG）會形成均勻的冰層，并使蛋白質顆粒吸附在UFG表面，分布在同一高度。

圖2：超平整石墨烯膜的設計和批量制備。? 2022 The Authors

a、銅箔上生長的粗糙石墨烯膜的照片。 b、粗糙石墨烯的原子力顯微鏡（AFM）圖像（上）和相應的示意圖（下），顯示銅箔表面的粗糙石墨烯具有密集的褶皺。 c、在銅箔和Cu（111）/藍寶石晶片上生長的石墨烯膜的光滑度表征。 d、生長在Cu（111）/藍寶石晶片上的超平整石墨烯的照片。 e、超平整石墨烯的原子力顯微鏡圖像（上）和相應的示意圖（下），顯示石墨烯在晶片上的原子級平整表面。 f、將超平整石墨烯批量轉移至電子顯微鏡載網的流程示意圖（上）和實際照片（下）。 g、超平整懸浮石墨烯的典型原子力顯微鏡圖像（下）和示意圖（上）。紅色曲線表示沿著孔中白色虛線標記的石墨烯的高度變化，ΔH是最大高度差異。 h、粗糙懸浮石墨烯的典型原子力顯微鏡圖像（下）和示意圖（上）。

圖3：預拉伸的超平整石墨烯使冰層厚度更均勻。? 2022 The Authors

a, 納米壓痕實驗的示意圖。b、c，超平整石墨烯和粗糙石墨烯的力學強度(b)和預張力(c)的統計直方圖。超平整石墨烯具有0.2N/m預張力。d、e, 超平整石墨烯(d)和沒有預張力的粗糙石墨烯(e)在約10kPa的剪切應力下的起伏變化模擬。超平整石墨烯在剪切后仍然保持平整，而粗糙石墨烯的波紋幅度在相同的剪切應力下增加。f、g，左：示意圖顯示冷凍電鏡樣品制備時液體被濾紙吸走的過程。在此過程中，多余的溶液被吸去，留下超平整石墨烯(f)和粗糙石墨烯(g)上的薄液層。右：冷凍電鏡圖像顯示超平整石墨烯(f)上的均勻玻璃態冰和粗糙石墨烯(g)上的波浪形玻璃態冰。

圖4：超平整石墨烯和粗糙石墨烯制備的冷凍樣品的電鏡成像效果的表征。? ? 2022 The Authors

a.冷凍電鏡照片表明使用粗糙石墨烯支撐的冷凍樣品在高傾角下出現明顯皺紋，影響了顆粒的信號。b. 示意圖和圖表顯示20S蛋白酶顆粒主要分布在石墨烯表面，高度分布變化約20納米。c. 粗糙石墨烯支撐的冷凍樣品的三個切面表明，顆粒分布存在高度變化，不均一。d. 用帶有能量濾波器的電鏡對粗糙石墨烯支撐的冷凍樣品進行成像，顯示冰厚度分布不均勻。e. 用超平整石墨烯支撐的冷凍樣品在傾斜時成像沒有明顯的皺紋。f. 超平整石墨烯支撐的冷凍樣品中的顆粒吸附在石墨烯表面，處于同一高度。g. 紅色箭頭指示的三個切面表明使用超平整石墨烯支撐的冷凍樣品的高度變化較小。h. 用帶有能量濾波器的電鏡對超平整石墨烯支撐的冷凍樣品進行成像，冰厚度分布均勻。i. 粗糙石墨烯支撐的冷凍樣品和超平整石墨烯支撐的冷凍樣品的顆粒欠焦值分布不同，說明粗糙石墨烯支撐的冷凍樣品中顆粒的高度分布差異更大。j. 樣品顆粒隨著成像劑量積累而產生漂移現象，但顆粒在超平整石墨烯支撐的冷凍樣品中移動更小。k. Guinier圖表明，超平整石墨烯支撐的冷凍樣品的圖像質量更好。

圖5：單顆粒冷凍電鏡對三個分子量較小的生物樣品進行高分辨率結構測定。? 2022 The Authors

a、d、g：超平整石墨烯支撐的血紅蛋白(a)、α-胎蛋白(d)和鏈霉親和素(g)的冷凍電鏡圖像。插圖顯示了顆粒的二維分類平均結果。比例尺為20?nm。b、e、h：最終重構分辨率為3.5 ?的血紅蛋白密度圖 (b)，2.6 ?分辨率的α-胎蛋白(e)，2.2 ?分辨率的鏈霉親和素(h)。c、f、i：從血紅蛋白密度(c)和α-胎蛋白密度(f)中選擇出來的局部的密度與相應的原子模型搭建結果；從2.2 ?鏈霉親和素密度中提取的代表性氨基酸殘基的密度與相應的原子模型(i)。

五、【成果啟示】

總言之，本文介紹了使用在Cu（111）/藍寶石晶片上生長的超平整石墨烯，通過面對面轉移方法批量化制備的電鏡載網。與常用的銅箔生長的石墨烯支撐膜相比，超平整石墨烯具有優異的機械強度，能夠更好地控制均勻薄冰，提高冷凍電鏡圖像質量。利用超平整石墨烯載網，作者解析出血紅蛋白、α-胎蛋白和鏈霉親和素的較高分辨率的冷凍電鏡結構。另外，超平整石墨烯將可以實現更可控的生物活性功能化修飾，高親和力和生物友好性地識別目標生物分子。這項工作為其他二維材料在結構生物學中的應用提供了啟示。

原文詳情：Zheng, L., Liu, N., Gao, X. et al. Uniform thin ice on ultraflat graphene for high-resolution cryo-EM. Nat Methods 20, 123–130 (2023).

https://doi.org/10.1038/s41592-022-01693-y