Nature Nanotech. 美國圣母大學成功利用亞納米孔讀取蛋白質一級結構分辨度達0.07nm3

引語：蛋白質測序是研究蛋白質不可回避的問題之一。近日，美國印第安納州，圣母大學的Gregory Timp教授在蛋白質測序工作中獲得新進展。

蛋白質的一級結構包含有氨基酸序列，這是決定蛋白質如何折疊以及具有怎樣功能的關鍵因素。然而，諸如質譜法、埃德曼降解法等傳統的蛋白質測序方法，都受制于短序列和低靈敏性等，所以人們一直在尋找更有效的辦法。作者報導了一種通過氮化硅薄膜濺射而得的直徑在亞納米級別的孔，能夠用來檢測變性蛋白質分子的一級結構。在電解質中變性蛋白分子在電場驅動下通過這種亞納米孔，測得的電流阻塞顯示了近乎規律的波動，其數量與蛋白質殘基的數量一致。此外，波動的振幅，與蛋白質一級結構中四殘基的阻塞體積相關性很高。因此，每一個波動都表示對四殘基的讀取，這就說明亞納米孔對讀取阻塞體積是足夠靈敏的，其中阻塞體積與單個殘基轉譯后的修飾相關，測量體積差異為0.07立方納米，但其靈敏度還無法達到識別全部的20種氨基酸之間的阻塞體積。

圖1 使用亞納米孔檢測單蛋白質分子

a-c, 公稱直徑為0.7nm(a)，0.5nm(b)，0.3nm(c)的亞納米孔的（i）TEM照片，（ii）多層模擬，（iii）2D投影，（iv）3D描述示意圖。亞納米孔通過由10nm厚的氮化硅薄膜濺射而得。散粒噪音與穿過孔的電子轉移相關。
d, 連續的電流示蹤圖像。結果表明持續和部分阻塞電流與1V時穿過孔的CCL5的單個分子的移位相關。高電壓會導致更大的阻塞電流。
e, 通過孔的蛋白質分子移位的原理示意圖。改性劑使得蛋白質帶上一致的負電荷使其形成了桿狀結構。
f-h, 熱點圖描述了部分阻塞的分布特征。圖中展示了開孔電流（ΔI/I0）與阻塞持續時間（Δt）的關系，與通過孔的變性CCL5移位相關，橫截面f -1.4 × 1.6 nm2, g-1.4 × 1.6 nm2, h-0.3 × 0.3 nm2。白色輪廓線表示該區域包含50%的阻塞。
i, 對應于f，熱點圖顯示了阻塞電流分布，與通過孔的變性的BSA移位相關。這種分布很容易與CCL5區分，因為能量間隔較大，為Δ=1.6 ×10-4。
j,k, 阻塞分布的熱點圖，分別描述了與之相關的通過孔的變性H3N和H3A移位。這些分布難以被區分，因為其能量間隔只有Δ=3.8 ×10-5。

圖2 使用亞納米孔檢測單蛋白質分子中的氨基酸

a, 與通過亞納米孔的單CCL5分子的移位相關的阻塞電流中的有單阻塞產生的幾乎規律化的波動的部分展開放大圖（數據為圖1d的前一部分）。這種波動來自于一次進（或出）亞納米孔的獨立的殘基。
b-d, 與a對應，曲線為幾乎規律化波動曲線的部分展開放大圖，其數量在成熟的CXCL1(b)，BSA(c)，H3N(d)中的通過亞納米孔的AAs數量相關。圖像曲線用高斯分布擬合。
e, 對阻塞和不同的持續時間警醒傅里葉分析得到波動數量，使用的是與a-d中相同的四種蛋白質。計數與阻塞持續時間獨立，但依賴于蛋白中殘基的數量。（注：AAs，原文中amino acids的首字母縮寫，即氨基酸。）

圖3 蛋白質序列分析

a, 通過橫截面為0.5×0.6nm2孔（紅色）的CCL5的400-阻塞共有序列，與阻塞提及模型（設k=3，藍色）和單一高關聯結果（C=0.69，藍色）。曲線上方的誤差圖標明了讀取結果的保真度。標明正確或錯誤讀取的灰度誤差圖在下方給出，灰色代表正確讀取，黑色表明是錯誤讀取。CCL5的正確讀取百分比為65.2%。
b, 對應于a，為通過孔的CXCL1的45-阻塞序列。盡管阻塞數量較低，但從下面的誤差圖來看，其讀取的保真度提高了，對CXCL1的正確讀取百分比為84.7%。
c, 對應于a，為通過孔的H3N5的52阻塞序列。其正確讀取百分比為90%。
d-f, 不同殘基的體積誤差。d-CXCL1，e-CCL5，f-H3N。
g, 部分平均讀取誤差與CXCL1、CCL5、H3N中殘基的體積的函數關系。較小的AAs是誤差的主要來源。虛線為數據進行最小二乘法擬合所得，方便讀者觀察。

圖4 亞納米孔對分子體積的靈敏度測試

a, 182-阻塞序列，與阻塞體積模型（假設k=4，黑色）和單阻塞（藍色）并列。插圖：從阻塞和E20的不同持續時間所得的波動數量。盡管平均數（N-E20=22.5）與阻塞持續時間相獨立，但不精確。
b, 與a對應，是通過橫截面0.4×0.5nm2（紅色）亞納米孔的嵌段共聚物R-G的58-阻塞序列，與阻塞體積模型（假設k=4，黑色）和單一高相關阻塞（C=0.90和0.96，藍色）。
c,d, 單位點化學改性對組織蛋白H3尾肽在阻塞波動振幅的影響。原始H3N（淺藍）和K9-酰化的H3A（圖4c中深藍色，231-阻塞，放大到原始H3）和K9-甲基化的H3M（圖4d中深藍色，958阻塞體積，放大到原始H3N）的序列形成，并列在相同曲線上再比較。可以觀察到，波動的振幅在位置6和11之間得到增強，表明此處有增加的阻塞體積。下方是原始序列和修飾后的序列間的差異軌跡（灰色）在與H3A/H3M相關的部分阻塞（黑色虛線）中表現出顯著的“頂帽狀”增加。

小結：作者在掃描透射式電子顯微鏡（STEM）中利用電子束誘導濺射在氮化硅薄膜中制備出亞納米級微孔，其直徑小于 α-螺旋的尺寸，從而大大提高了化學特異性。作者利用這種亞納米級的孔洞進行蛋白質測序。作者發現，阻塞電流與通過亞納米孔的單變性蛋白的移位相關，電流的波動會造成對蛋白一級結構讀取的低保真度。對于應用于DNA的納米孔定序器，低保真度的讀取和能夠影響阻塞電流的多重單體并沒有對蛋白質測序造成不可避免的問題，有一種算法適用于解碼AA序列。然而，亞納米孔靈敏度任然是一個開放性問題。當序列足夠大時，讀取會足夠靈敏來在單一殘基上測試PTMs，但靈敏度還不足以達到所有AAs彼此之間的識別。

注：α-螺旋，是在蛋白質中發現的常見的二級結構，其大小與水合離子尺寸相當，其直徑小于0.5nm，每增加一個殘基大小增加0.15nm。

原文鏈接：Reading the primary structure of a protein with 0.07 nm3?resolution using a subnanometre-diameter pore??Nature Nanotechnology， 2016，?DOI: 10.1038/NNANO.2016.120

本文由編輯部提供素材，李卓整理編譯。

材料牛網專注于跟蹤材料領域科技及行業進展，這里匯集了各大高校碩博生、一線科研人員以及行業從業者，如果您對于跟蹤材料領域科技進展，解讀高水平文章或是評述行業有興趣，點我加入編輯部。