學術干貨丨共聚焦顯微鏡中熒光團的共定位

在多標熒光樣品圖像中，因兩個或多個熒光團在顯微結構中距離很近，經常會有發射信號疊加，這種效應就稱為共定位。目前，高特異性合成熒光團和經典免疫熒光技術的應用、精密光切技術的應用、共聚焦和多光子顯微鏡提供的數字圖像處理技術等大大提高了生物樣品中共定位檢測的能力。

圖 1

共定位在生物表述上是這樣定義的：兩個或多個不同的分子位于樣品上同一個物理位置。對顯微鏡中看到的組織切片、單個細胞或亞細胞器官，共定位意味著不同的分子連接到同一個受體上；在數字圖像方面，這個術語指的是不同熒光分子發射的顏色分享圖像中的同一個像素。在共聚焦顯微鏡中，樣品被記錄成含有很多像元的多維陣列數字圖像，每個像元代表一個三維像素。像元的尺寸（或檢測單元）由物鏡的數值孔徑、照明波長以及共焦檢測針孔直徑等決定。因此，在一個樣品中兩個熒光探針的共定位，比如發綠光的 Alexa Fluor488，發橘紅色光的 Cy3，在圖像中就是由含有紅色和綠色兩者貢獻的像素表示（經常產生各種各樣的橘色和黃色）。

舉一個例子， 圖 1 的一系列圖表明了骨骼肌動蛋白和黏著斑蛋白側向光學平面上的共定位（激光掃描共聚焦顯微鏡中的 XY 面）。這些共定位點可作為肌動蛋白絲的成核位點，也可作為外部介質、質膜和肌動蛋白骨架之間的交聯劑。圖 1（ a）是 Alexa Fluor 568 通道（目標對象是黏著斑蛋白），由 543nm 的氦氖激光器激發；而 Figure1（ b）是 Alexa Fluor488 通道(目標對象是絲狀肌動蛋白)，由 488nm 的氬離子激光器激發； Figure1（ c）是前面兩幅圖的疊加，表明兩種熒光信號在絲狀肌動蛋白纖維末端的共定位。必須指出的是，共定位并不指的是具有相似發射光譜的熒光團出現在合成圖像的同一個像素上。準確的共定位分析只有在熒光團的熒光發射光譜足夠分離且濾色片（或光譜狹縫寬度）正確設置的情況下才有可能。熒光團發射光譜之間的大量疊加或濾色片組合的不正確使用，都可能導致光譜串色，這種情況下共定位的測量就沒有意義。為了避免產生共定位假象，熒光團必須與照明光源的光譜認真匹配（共聚焦中是激光線），來獲得最大激發效率，同時在發射光譜之間保持一定的分離度。在大多數情況下，對共定位分析來說，熒光團的選擇對獲得滿意結果極為重要。

在圖 2 中，對 Alexa Fluor 染料家族的光譜疊加作了比較，這在共定位實驗中是很有用的。為了比較，所有的發射光譜都做了歸一化，疊加區域用灰色陰影顯示。在圖 2(a) 中，綠色熒光染料 Alexa Fluor 488 和橙黃色熒光染料Alexa Fluor 555 在峰波長處顯示很明顯的分離，人眼也很容易能夠區分。然而，光譜疊加（灰色陰影區域）表明在 Alexa Fluor 555 的發射峰上很明顯有 Alexa?Fluor488 的發射光譜（用一條黑線標示，從發射峰到橫坐標）。當 Alexa Fluor?488 的熒光發射強度明顯比 Alexa Fluor 555 的熒光發射強時，熒光信號這么高程度的串色使得熒光探針的分離很難。很多因素都會導致這種情況發生，比如熒光團標的物濃度的巨大差異。因此，在共定位實驗中，這些探針的組合就應該避免，或只有當圖像在多通道共焦模式采集下才可以使用，這樣可以降低或消除串色。

圖 2

Alexa Fluor 探針之間的光譜疊加程度會隨著探針發射峰之間的距離增加而下降，如 Figure2(b)所示。在這種情況下， Alexa Fluor 488 和深紅色染料 Alexa?Fluor 633 與 Figure2 (a)比較，重疊區域明顯降低。這兩種染料人眼都很容易區分，光譜重疊程度低在共定位實驗中可使串色最小化，如每個探針的濃度相似的話，應該可以產生較好的結果（注意：深紅色的熒光染料 Alexa Fluor 633 在低濃度時通過顯微鏡目鏡很難觀察到）。 Alexa Fluor 633 可被紅色氦氖激光器的 633nm 線最有效的激發，也可被黃色氦氖激光器的 594nm 激發。或許，在 Alexa?Fluor染料發射的可見光區域，最好的光譜分離是 Alexa Fluor 488和 Alexa Fluor?647 的結合（圖中未顯示）。實際上，在這些染料之間沒有光譜重疊，即使樣品含有過量的 Alexa Fluor 488，應該也沒有串色。具有這些特點的熒光探針是共聚焦顯微鏡分析共定位的理想選擇。

在共聚焦顯微鏡中，測定共定位的能力受限于光學系統的分辨率及用于照明樣品的入射光波長。寬場熒光和共聚焦顯微鏡理論分辨率約為 200nm，但在實際上，由于各種原因這個數降到 400nm 和 600nm 之間，原因包括顯微鏡光路未完全對準、光學折射率波動、光學像差及樣品制備的不合適。然而，對于一個已經完全調好的共聚焦顯微鏡來說，兩個熒光分子是否連接到同一個目標對象上，或者它們是否定位在同一個器官上受光學分辨率影響。共定位的許多實驗是圍繞高特異性的合成探針和抗體進行的，標記目標是容易區分的局部的、明確的細胞結構。

對于厚度小于 5μm 的樣品，比如貼壁細胞或很薄的組織切片，在常規的寬場熒光顯微鏡下，定量的共定位分析一般是可以的。然而，對于厚樣品，圖像應以具有一定軸向尺寸的光學切片來記錄，來分析看起來共定位的熒光團是否真正位于同一個側向焦平面上，或在 Z 軸上他們是否彼此疊加。厚樣品的熒光團共定位分析應通過獲得薄的光學切片來進行，可用激光掃描共聚焦顯微鏡、或轉盤共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡。多光子顯微鏡經常用單個近紅外激光，在物鏡焦點處的特定區域激發雙標樣品的兩個熒光團。這些技術將熒光發射局限在僅位于焦平面上的熒光團，這樣大大降低了光漂白和背景噪音。

共定位的軟件分析

樣品中熒光團共定位的程度是通過比較一幅圖上每個像素位置的顏色值測定的。分析的第一步就是要顯示進行共定位測量的圖，一般以兩個獨立通道的合成圖顯示。當分析多標樣品時，在一次計算中，只能處理兩種偽彩，但所有偽彩排列之后都可以配對用于共定位分析。由于傳統上使用氬離子激光器、氪-氬離子激光器及氦氖激光器，這些激光器能夠有效地激發在藍色和綠色區域有強烈吸收的熒光團，因此選擇紅綠顏色對作為共聚焦熒光顏色。此外，人眼對綠色和紅色色調更為敏感。

圖像的共定位分析一般經常用散點圖表示（ scatterplot），這個圖將兩套數據關聯起來。散點圖以二維圖的形式描述了一幅圖或一個感興趣區域每個像素處一個通道對另一個通道的強度值（見圖 3 和圖 4）。作圖時其中一個通道（通常是綠色）作為 x 軸，而另一個通道（通常是紅色）作圖時作為 y 軸，在橫坐。標和縱坐標上強度范圍是 0～4095. 因此，合成圖的每個像素點都有一對強度值。分析每一對強度值產生的分布圖案，能夠識別熒光團的共定位、區分背景、串色、光漂白等。

圖 3

圖 3 描述了共聚焦的三個合成圖（偽彩為紅色和綠色），以及對應的散點圖，三個樣品熒光團共定位的程度不同。每個通道中強度很低的像素位于靠近散點圖的（ 0,0）處，而越亮的像素分散得越遠。在連接紅色通道和綠色通道的散點圖中，純的紅色和綠色的像素點往往會團聚在軸位置。而共定位的像素（如果有的話）看起來是彩色的，具有黃色和橙色的色調（取決于共定位的程度），落在 y=x位置附近，也就是散點圖的右上角。

圖 3a 顯示的樣品為鼠腦冠狀位海馬切片，用 Alexa Fluor488 標記神經纖維，Alexa Fluor568 標記神經膠質原纖維酸性蛋白， GFAP。在圖 3b 中，印度麂鹿皮膚成纖維細胞用 Alexa Fluor568 染色，標記對象是黏著斑蛋白，同時用 Alexa?Fluor488 與鬼筆環肽作用，標記對象是纖維狀的肌動蛋白。而表達了熒光蛋白DsRed 和 EYFP 的兔腎上皮細胞，定位在核上，在圖 3c 中描述。相關的散點圖直接位于樣品圖像的面，例如圖 3d 是圖 3a 的散點圖，兩個通道共定位的程度在每個散點圖的左下角用白色字母和數字表示。圖 3a 共定位程度相對較小（只有百分之幾），在圖 3b 和圖 3c 中共定位程度逐漸增加，共定位系數分別是 30%和85%。

共聚焦顯微鏡及配件制造商提供的軟件可對熒光團共定位進行散點圖分析。圖 4 顯示了一系列分析圖，這個圖是印度麂鹿皮膚成纖維細胞，用 AlexaFluor568 染色（標記對象是黏著斑蛋白，紅色通道），同時用 Alexa Fluor488染色（標記對象是纖維狀肌動蛋白，綠色通道）。在散點圖中選擇一個感興趣區域進行分析，在圖 4a 中用白顏色的長方形為這個感興趣區域設定了信號的閾值，大多數共定位分析軟件都可以進行這種功能分析。

感興趣區域的水平邊界和豎直邊界應該排除背景信號，背景沿著散點圖的 x軸和 y 軸團簇。只有被包括在所選擇區域邊界內的像素信號才能進行共定位分析。樣品上重疊的像素區域很容易轉變成共定位二元閾值像(圖 4b)，這個圖還可以和共聚焦圖疊加在一起，做一個共定位 map. 圖 4c 顯示的共定位 map 圖用白顏色顯示了共定位區域，對大多數軟件這個顏色很容易變成其他顏色，相對于原來的偽彩，對比度更高一些。

圖 4

正如上面所討論的，在共聚焦圖中對熒光團共定位的定量測定，可通過散點圖和感興趣區域的信息獲得。從整個散點圖的信息，可獲得很多變量值。Pearson′s 系數就是用于分析整個散點圖的諸多變量中的一個，為描述兩幅圖之間重疊程度，在識別一幅圖像和另一幅圖像的匹配程度上， Pearson′s, R(r)系數是標準技術之一。 Pearson′s 相關系數根據下面方程計算：

S1 是第一個通道每個像素的強度值，而 S2 是第二個通道每個像素的強度值。S1(average)和S2(average)分別是第一個通道和第二個通道平均像素強度值。在 Pearson′s 系數里，原始像素強度值減去平均像素強度值。結果，系數值范圍從-1到 1， -1 表示圖像的像素之間完全沒有重疊，而 1 表示完美的圖像重疊。Pearson′s相關系數只解釋了兩個圖像之間形狀的相似性，而與圖像像素強度值無關。然而，當把這個系數值應用到共定位分析時，潛在的負值難以解釋，需要用另一種方法解釋結果。

用于計算另一相關系數的較簡單的技術，需要去掉原始像素強度值和平均像素強度值這個差減項。 正式定義為 Overlap 系數（ R） ，這個值范圍從 0 到 1，在圖像分析中對強度變化不敏感。 Overlap 系數定義為：

分子是兩個通道強度的乘積和，只有當同一個像素的兩個通道值與共定位相關時，分子才會給出一個很有意義的值（兩個通道的像素強度值都大于 0）。因此，方程（ 2）的分子與共定位的像素數成正比。同理， Overlap 方程的分母正比于圖像兩個通道組分的像素數，而不考慮共定位是否存在（注意：組分定義為通道 1 和通道 2 紅顏色和綠顏色的圖或像素陣列）。 Overlap 系數的一個主要優點就是對一個圖像上各種組分的信號強度差相對不敏感，信號強度差經常是由熒光團的濃度差、光漂白、量子效率變化及非等效的電子通道設置等產生的。

使用 Overlap 系數最重要的缺點是：通道之間組分像素數比例會強烈影響Overlap 系數值。為了減少這種依賴性， Overlap 系數分成兩個不同的子系數，看 k(1)和 k(2)，以兩個獨立的參量來表達共定位的程度。 Overlap 系數 k(1)和 k(2)描述了通道之間強度的差異， k(1)對通道 2（綠色信號） 強度差敏感，而 k(2)線性依賴于通道 1 像素的強度值。因此，現在描述的方程能夠說明重疊度，也能解釋顏色通道之間的強度差異。在圖像的共定位區域，為了估計其中一個顏色通道對整個共定位熒光的貢獻，定義了另外一套共定位系數 m(1)和 m(2)。

共定位系數 m(1)用于描述通道 1 對共定位區域的貢獻，而共定位系數 m(2)用于描述通道 2 對共定位區域的貢獻。注意，如 S2(i)大于 0 時，變量 S1(i,coloc)等于 S1(i)；對于變量 S2(i,coloc)也是這樣的。相對于每個熒光通道的總熒光量來說，這些系數正比于 merge 圖像中每個熒光通道共定位熒光團的熒光量。即使當兩個熒光通道的信號強度明顯在不同的檔次，共定位系數 m(1)和 m(2)也能測定。

另一對共定位系數可對散點圖上定義的感興趣區域內像素強度范圍進行計算。系數 M(1)用于描述通道 1 熒光團對共定位區域的貢獻，系數 M(2)用于描述通道 2 熒光團對共定位區域的貢獻。

式中，如 S2(i)位于感興趣區域閾值范圍內， S1(i,coloc)等于 S1(i)；如 S2(i)代表的像素在感興趣區域閾值外， S1(i,coloc)等于 0.相似地， 如 S1(i)位于感興趣區域閾值范圍內， S2(i,coloc)等于 S2(i)；如 S1(i)代表的像素在感興趣區域閾值外， S2(i,coloc)等于 0. 換句話說，對每一個通道來說，分子代表這個通道所有像素（且每個像素在另一個通道也有強度值）的強度和，而分母代表這個通道的所有像素的強度和。相對于每個通道的總熒光量來說，這些系數與每個通道共定位對象的的熒光量成正比。

大多數商業共定位分析軟件都能計算上面所描述的參數，包括 Pearson′s 相關系數、總 overlap 系數以及 k(X)， m(X)和 M(x)共定位系數。此外，許多分析軟件包含的算法可進行背景校正，產生整幅圖的散點圖，且可在一個雙通道合成圖或共聚焦圖的感興趣區域進行計算。從這些軟件中獲得的最重要的數據就是共定位系數，這意味著信號之間重疊的相對程度。例如，通道 1 的熒光團共定位系數為 0.75 意味著通道 1 中含有通道 2 組分的強度值占通道 1 總的強度值是 75%。這是一個相對比較高的共定位程度。同樣地，對通道 2 共定位系數為 0.25 意味著明顯降低的共定位。

共定位分析中的假象及樣品考慮

共定位分析遇到的一個最重要的問題就是由發射光譜疊加、自熒光（主要存在于組織樣品）、非特異性抗體或合成熒光染料染色引起的光譜串色。熒光共振能量轉移對于光譜有疊加的共定位熒光團來說也是一種潛在的假象。當觀察標記有綠色、紅色熒光探針的樣品時，任何這樣一種假象都能產生看起來是黃色或橙色的像素，但這種顏色并不來自共定位。

當對兩種或兩種以上熒光染料標記的樣品進行成像時，最常見的問題就是熒光串色問題。例如，當用傳統的綠色和紅色熒光探針熒光素和羅丹明進行雙標時，串色只有用最優的熒光濾色鏡組才能降低，但絕不會完全去掉。這是因為這樣一個事實：這些染料都有很寬的吸收和發射光譜，光譜之間有明顯的重疊。因此，激發熒光素的氬離子激光器的 488nm 線也能激發羅丹明，盡管激發程度較低。而且，在為羅丹明預設的光電倍增管通道或寬場濾色鏡套組中也會檢測到熒光素的熒光發射，甚至在沒有共定位的地方，產生看起來是黃色或橙色的像素。要用這些染料或類似染料進行共定位實驗時，串色問題必須完全消除。

成探針克服，比如 Alexa Fluor 系列或 Cy 系列染料。這些專門設計的有機分子表現出很窄的發射光譜（與傳統探針相比）、與弧光燈和激光線相匹配的較大的吸收系數、較高的量子產率、降低的光漂白,且熒光發射對環境變量的依賴性較低。此外，這些先進探針的激發光譜線橫跨大約 400nm，從紫外到近紅外有一個很寬的選擇，以匹配照明光源，使得發射光譜疊加最小。

自發熒光（對甲醛固定的組織樣品尤為顯著）產生的問題在表現上與串色類似。有自發熒光的樣品激發后經常會在其他通道檢測出熒光發射，使得到的照片看起來有共定位熒光團。如用抗體和合成熒光團對背景過度染色，也會在兩個熒光團非特異性標記明顯的地方產生看起來像共定位的圖像。這個假象可以通過認真地制備樣品、用合適的 control 監測實驗方案來避免或明顯降低。

只有當所有的串色、自發熒光、非特異性熒光問題都消除掉后，共定位的研究才是準確的。在激光掃描共聚焦顯微鏡中，最有效的方法就是利用序列激發，并用窄的帶通發射濾色片或窄的狹縫寬度（光譜型）收集發射熒光。同時，應該檢查單標的 control 樣品，以確保完全消除了串色，未染色的 control 在監測自熒光方面是很有效的。

圖5

激光掃描共聚焦顯微鏡中各種樣品串色的問題及其校正在圖 5 中顯示。圖 5（ a）中的纖維原細胞， Alexa Fluor488 綠色熒光串色進入 Mito Tracker 紅色通道，當樣品用 488 激光和 543 激光同時掃描時，會產生黃色的肌動蛋白絲。序列掃描和檢測（圖 5d）消除了串色影響。同樣地，在用 Cy3 和核探針 DRAQ5 對老鼠大腸厚切片進行同時掃描時（圖 5b），也會發生串色。序列掃描可以去掉串色假象（圖 5e），而串色假象會造成虛假的共定位。

當多標樣品用兩種以上的激光掃描時，串色問題在好幾個通道都會觀察到，圖 5（ c）和圖 5(f)顯示了鼠腦的一個厚切片，用 Alexa Fluor488 標記神經絲、用 Alexa Fluor 568 標記神經膠質纖維酸性蛋白(GFAP)，用 DRAQ5 染核。當樣品同時用 3 個激光掃描時（圖 5c），串色會在第二和第三個通道發生，在樣品的中間絲里就意味著有可能的共定位。然而，若開始用序列掃描并收集數據時，神經絲只出現在它們各自的通道里（圖 5f），消除了這些結構中熒光團共定位的可能。熒光共振能量轉移(FRET)，理論上可以測量位置離得很近的兩個熒光團的距離，也是監測共定位的一個潛在有用的工具。然而，在共定位分析中這個現象經常會導致一些假象，除非在實驗的設計過程中，對 FRET 的一些參數做了很好地理解并認真進行了考慮。尤其是在第一個熒光團的發射光譜和第二個熒光團的激發光譜重疊的地方，研究者應該特別關注。這些樣品中的能量轉移表現為：第一個熒光團的熒光發射意外地降低同時伴隨著第二個熒光團的熒光發射意外地增加。緊密相關的熒光團之間的相互作用可導致發射熒光信號的淬滅，這與環境條件有關。

共定位分析中許多潛在的問題都可通過仔細關注樣品制備技術來規避。正如上面討論的，熒光探針應該選擇發射光譜分離比較大的且具有最小疊加的組合。如果可能的話，選擇綠顏色的具有窄發射的熒光團（比如 Alexa Fluor 系列或量子點）及紅顏色的在深紅區或近紅外區有發射的熒光團。原發性和繼發性抗體必須檢測交叉活性及非特異性背景染色。合成熒光團及標記的繼發性抗體的濃度應該優化以確保相似的亮度，尤其是當對象豐度根本不同時。影響熒光團亮度的因素包括激發效率、量子產率、消光系數、濃度及環境因素，如 pH值、離子濃度、疏水性及粘性。對每一個熒光團都應單獨制備 control 樣品，在不染色的情況下，分別分析串色和自熒光。仔細注意著色過程中的微小細節，就會降低使用圖像處理軟件恢復數字圖像的必要性。

共定位分析的實際情況

在分析復雜的熒光圖像時，使用偽彩色組合很有用，這在上面已經討論過了。通常，選擇兩個彩色通道，最常用的是綠色和紅色。因此，疊加區域顯示黃色。其他顏色對，比如藍色、綠色（產生青色），藍色、紅色（產生紫色）也會用到，但因為反射的藍光對人眼靈敏度低，這些顏色對在實際觀察中很少使用。但在許多情況下，尤其是三色圖像，不可避免會使用藍色偽彩色。

采集圖像及顯示參數方面，應該采用一種標準以便使合成圖對每一個熒光信號顯示同樣的動態范圍和補償。事實上，標準的共聚焦顯微鏡操作將這種方法視為日常樣品分析方法。兩個圖像 merge 時，如果收集到的光子足夠，疊加的紅色綠色信號就會產生明確的亮黃色。在光子極少的實驗中，共定位熒光團會產生暗黃色，而對背景具有相同貢獻的綠色和紅色會顯示棕色。

每一個通道的 offset 和 gain 都應該單獨調節（設置背景為 0，飽和為 4095），以便每一個熒光團都顯示在完整的 12 位范圍里。然后，對每個圖像進行單獨處理。盡管這是采集和顯示多色圖像的一個很方便的方法，但樣品中兩個信號的實際相對強度沒法測定，因為每個信號的采集都是為了滿足整個 12 位的圖像深度。因此，某一個顏色通道相對信號強度的分析要求各個通道以同樣的采集參數配置，比如光電倍增管電壓、增益和補償等。

如果圖像采集和圖像處理技術沒有平衡好，在 merge 的彩色圖中，就會由于采集過程光電倍增管不合適的 Gain、 offset 配置及圖像處理過程中強度直方圖的極端拉伸而對共定位做出不準確的解釋。舉個例子，如果 offset 值過高，就會發生很明顯的顏色分離，在低 offset 值下，在同樣的結構下，觀察到的對比度就降低。對于一些關鍵應用， ratio 成像技術可用于區分兩個信號是共定位還是只是部分疊加。

圖6

對完全校準好的熒光成像系統，當用不同的濾色鏡組時，樣品上一個點在檢測器上精確成像為一個點，也就是像素對像素。然而，不同顏色的通道 merge 時，物鏡的色差校正不夠、濾鏡光路沒有完全對準都會使得熒光信號之間的記錄有差錯。對具有復雜圖案的圖像或明暗信號相混的圖像，這個可能就檢測不到。會得出這樣的結論：在結構中的信號分布要么是明顯不同，要么是部分疊加的。

在 merge 圖像的處理過程中，位移問題可用許多軟件包通過 panning 操作恢復原始記錄。通過 panning 操作校正一系列不同顏色圖的過程中，需要樣品上有一個固定的參考點，這個參考點在每一層圖上都有。如不存在多標的樣品參考點，就將多色的熒光微球稀釋后加入樣品中，用蓋玻片進行封裝前，在每個視野中都會有幾個珠子。對于一些苛刻的應用，幾個帶通二色鏡和發射濾色片可與不同的激光器或熒光團特定的激發濾色片一起使用。這種濾光鏡組的配置一般用在共聚焦顯微鏡中，當對顏色校正要求苛刻時，也可用于寬場熒光顯微鏡。

圖 6 顯示了上面討論的幾個常見問題，多標樣品（注意：圖 6 中所有熒光團都只顯示綠色和紅色兩種偽彩）經常會妨礙共定位的準確分析。用增強黃色熒光蛋白融合過氧化酶轉染人類女性骨肉瘤上皮細胞，目標對象是縮氨酸序列（發綠色熒光），隨后用免疫熒光的方法，用二次抗體標記 Alexa Fluor568(發紅光)，目標對象是過氧化酶膜蛋白（ PMP-70），顯示在圖 6（ a）和圖 6（ d）中。圖 6（ a）中的背景太黑，致使標記的黃色熒光蛋白強度降低。這種錯誤使共定位分析發生偏移，對綠色通道中重疊的像素人為產生了較低的檢測量。合適的圖顯示在圖 6（ d），顯示了明顯較高的共定位程度。

獼猴腎上皮細胞的線粒體網絡用 EYFP 和 HcRed1 熒光蛋白（此蛋白含有縮氨酸序列，目標對象是線粒體）轉染。成像過程中，非常亮的 EYFP 大大地遮蓋了HcRed1 發射的熒光信號，當檢測通道的電壓、增益和補償值接近時， HcRed1 發射的熒光信號比 EYFP 要弱幾乎 100 倍（圖 6（ b））。調整 HcRed1 通道 PMT 的值可平衡熒光蛋白的發射強度以克服這種差異，共定位程度明顯增加（圖 6（ e））。圖 6（ c）顯示幾個疊加通道重合不好，圖中顯示的是塔爾羊卵巢細胞，用 AlexaFluor488 耦合鬼筆環肽染色（目標對象是綠色絲狀肌動蛋白），用 Alexa Fluor568二次抗體染色，目標對象是粘著斑蛋白抗體（粘著斑）。肌動蛋白絲末端應該與樣品中粘著蛋白共定位，但在圖 6（ c）中，他們沒重合好，正如在圖像右下角用紅色和綠色熒光團標記的微球重合不好一樣。采集完圖像后，進行圖像處理可將通道對齊，恢復圖像的位置（也就是球的位置），為共定位分析提供了很好的樣本。

結論

當研究熒光團共定位時，要考慮的最重要的一點是：確保樣品標記的質量最好。抗體和合成熒光團都應進行特異性的分析和選擇，背景要低、沒有交叉活性。為了降低串色影響，發射光譜分得比較開的熒光探針組合最適合做共定位實驗。要做合適的 control 實驗，包括用每個探針單獨標記樣品及未標記的只有自發熒光的樣品，都應該制備，而且在真正的實驗條件下細致地觀察串色。樣品制備好后，儀器和軟件的參數都要關注。有一點很重要，要記住：樣品制備得不好并不能通過數字圖像處理技術克服。在大多數情況下，優化染色條件會節省大量的時間，最終產生較好的結果。

進行共定位分析還取決于儀器的配置要求，需要最高質量的消色差顯微鏡物鏡，這對于降低色差是很必要的，色差會影響共定位的定量計算。許多生產產商引進了平場復消色差物鏡，這種物鏡對色差在整個可見光范圍內（ 400-700nm）進行校正，可明顯有助于熒光顯微鏡的定量研究。所有的熒光發射濾色片都應該用與熒光團發射光譜匹配的帶通透射來優化。這是控制樣品中其他熒光團串色最重要的考慮之一。如果在 control 樣品中檢測到串色（用單一探針染色或未染色只有自發熒光），用裝有 AOTF（ acousto-optic tunable filter）的顯微鏡進行多通道序列掃描會產生最優的結果。

參考文獻

1. Olympus Microcopy resource center

2. HandBook of Biological Confocal Microscopy (THIRD EDITION) James B.Pawley

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