學術干貨丨掃描電鏡冷凍制樣及傳輸系統(Cryo-SEM)的應用

常規掃描電鏡的樣品室為高真空(10^-3Pa)環境，要求觀察的樣品干燥無揮發，而一些樣品在干燥過程中會發生結構變化(如囊泡等自組裝結構、凝膠、生物樣品等)，致使無法觀察其真實結構，掃描電鏡的低溫冷凍制樣及傳輸技術(Cryo-SEM)可實現對液體、半液體及對電子束敏感樣品的觀察。

1. 掃描電鏡冷凍制樣及傳輸系統簡介

冷凍掃描電鏡的制樣過程分為冷凍固定、冷凍斷裂、升華及導電性噴涂，首先是將樣品進行冷凍固定，冷凍固定過程盡量保持樣品的結構，使水在固化的過程中不結晶而成為玻璃態的水，這樣水的體積不會膨脹從而不會破壞樣品的原始結構，通常采用高壓冷凍的方法和液氮泥快速冷凍方法。高壓冷凍方法是在2100個大氣壓的壓力下用液氮將樣品冷凍，在此條件下水呈玻璃態。液氮泥是將液氮置于真空環境(約 0.1Pa)，此時液氮為“泥”狀，不沸騰，可快速冷凍樣品，減少樣品中水結晶的可能。冷凍固定后的液態樣品，經特殊的裝置在真空且低溫(-100℃)的環境下將樣品斷裂，露出新鮮的斷面， 然后在真空且溫度為-90℃的條件下，水進行升華，將包裹樣品的水升華后，進行導電性噴涂(一般噴 Pt)。至此，冷凍制樣工作完成，即可將樣品通過冷凍傳輸系統置于掃描電鏡的冷臺上（溫度可低至-160℃） 進行觀察。

圖1是分析測試中心電鏡室配置的掃描電鏡冷凍制樣及掃描電鏡的冷臺(配置于掃描電鏡 S-4300)，包括高壓冷凍儀(及我們自行研制的液氮泥冷凍裝置)、冷凍斷裂及噴涂儀、真空冷凍傳輸裝置及掃描電鏡中的冷臺。

高壓冷凍 ?冷凍斷裂/噴涂 ?真空冷凍傳輸 ?Cryo-SEM

2.冷凍掃描電鏡(cryo-SEM)的應用實例

圖2為酵母細胞(由酵母粉加水發酵制得)分別經高壓冷凍和直接液氮冷凍制樣，然后冷凍斷裂并進行導電性噴涂后置于掃描電鏡中觀察到的結構，可以看出兩種制樣方法都可觀察到不同截面斷裂的酵母細胞，高壓冷凍的制樣方法較完整的保持了酵母細胞的結構，而直接投入液氮冷凍的方法使得酵母細胞的結構受擠壓發生變形。

圖 3 為表面活性劑形成的囊泡樣品(膠體界面與熱力學實驗室樣品)通過高壓冷凍制樣，經冷凍斷裂并導電性噴涂后，置于冷凍掃描電鏡中觀察得到的表面形貌，可以看出經冷凍斷裂，有些囊泡保持了完整的球型結構，有些則從中間斷裂，從而可以看到空囊的結構。若以常溫的掃描電鏡觀察，樣品需要先干燥，而在干燥過程中囊泡會塌陷，無法保持其結構。

圖 4 為高分子/SiO2 復合微球樣品(高分子物理與化學實驗室樣品)經高壓冷凍制樣，冷凍斷裂并導電性噴涂后， 置于冷凍掃描電鏡中觀察得到的表面形貌， 可以看出此微球是由一個 SiO2球 (直徑約 200nm)和一個高分子球(直徑約 400nm)組成， 由裂開的球看出高分子球為空心結構， SiO2 球內嵌在其中， 整個微球表面是比較光滑的，在溶液中還散落些小顆粒的物質，這些散落的顆粒物質并沒有包覆在球上， 這證明在溶液中微球的表面并沒有小顆粒物質吸附。而若應用常溫掃描電鏡觀察，在樣品干燥的過程中，小顆粒會沉積在樣品表面，無法判斷小顆粒在溶液中是否吸附在微球表面。

圖 5 為水凝膠樣品(膠體與界面實驗室樣品)經經冷凍固定、冷凍斷裂并導電性噴涂后，置于冷凍掃描電鏡中觀察得到的表面形貌，可以看出此水凝膠為網狀結構，相比于水升華 6min.得到的形貌，升華 30min.可以將網狀結構中的水充分升華，從而能夠顯現水凝膠的三維網狀結構。因此，在實際樣品制備中，需要根據樣品摸索合適的水升華時間。

總之，掃描電鏡冷凍制樣及傳輸系統可實現溶液樣品及含水樣品的冷凍掃描電鏡觀察，避免了干燥過程樣品結構的改變，預計將在膠體、有機高分子、生物等樣品的微觀結構表征中發揮重要作用。但是冷凍掃描電鏡只適用于濃度較高的溶液或懸濁液樣品，對于濃度很稀的樣品，由于掃描電鏡只能看到表面一層的結
構，所以很難找到樣品，需要用冷凍透射電鏡進行觀察。

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本文轉載自中科院化學所分析測試中心，材料牛編輯整理。