Adv. Sci.: 果糖封閉苯硼酸修飾的多位點抗轉移膠束自傳遞系統用于增強黑色素瘤靶向治療

【引言】

腫瘤轉移是癌癥患者死亡的主要誘因之一，并且在臨床中抗腫瘤轉移藥物的短缺是治療侵襲性癌癥的主要障礙。研發可以原位消除實體腫瘤并且抑制腫瘤轉移的多功能藥物遞送納米系統對于治療侵襲性腫瘤是非常有益的。然而，用一個納米系統實現這些目標是非常具有挑戰性的。現有的抗腫瘤轉移策略主要是基于化學療法、基因療法和放射療法的聯合療法。此外，轉移級聯是所有腫瘤細胞發生血行遠端器官轉移的必經之路，尤其是腫瘤的肺轉移，其包含腫瘤細胞脫離原部位，經血管傳播，最終根植在其他遠端組織中的過程。腫瘤轉移之所以難以預測和治療，是因為其是一個極其復雜的、一系列的生物學過程，涉及多個步驟與環節，由眾多關鍵因子調控。鑒于轉移級聯在所有經血轉移的腫瘤中均存在，故以高效阻斷轉移級聯為目標設計出的多位點阻斷轉移級聯的藥物有望對大部分血行腫瘤轉移產生預防和治療效果。由于轉移級聯的多步驟性和復雜性，單位點抑制策略很難高效阻斷它，而多載藥物的多位點抑制策略雖能增加阻斷效率，但其可控性差且毒性易疊加。為克服以上障礙，作者設計了一種親疏水片段即可高效阻斷轉移級聯不同位點的膠束自傳遞系統。

【成果簡介】

近日，四川大學華西藥學院的何勤教授（通訊作者）等報道了一種多功能自傳遞的PBA-LMWH-TOS納米顆粒（PLT NPs），其可同時作為納米載體和抗腫瘤轉移劑，且能對多種惡性腫瘤轉移的血行轉移進行有效抑制。親水性片段（低分子量肝素，LMWH）可抑制腫瘤細胞和血小板之間的黏附作用。并且作者首次報道了疏水片段（D-α-生育酚琥珀酸酯，TOS）可有效抑制B16F10細胞中基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達。實驗結果表明可多位點阻斷轉移級聯的空白NPs在三種小鼠轉移模型中顯示出優異的抗腫瘤轉移能力。另外，腫瘤細胞上唾液酸（SA）殘基的過表達與癌癥的惡性程度和轉移表型有關，留的惡性轉移程度越高，SA的表達量越高，因而3-氨基苯硼酸（PBA）修飾的載DOX的膠束自傳遞系統可同時實現針對高轉移性實體瘤及其轉移灶的靶向治療。此外， PBA與單糖的結合且受pH值的影響，作者據此設計了簡單的pH敏感的“果糖（Fru）封閉”策略來降低PBA的脫靶效應。即正常組織pH7.4左右，PBA可與單糖較穩定結合，使其難以識別正常組織中的唾液酸殘基。腫瘤中偏低的pH（pH6.5左右）環境使單糖與PBA的結合變得不穩定，暴露出PBA，恢復其對腫瘤細胞表面唾液酸受體的識別作用，使其重新獲得靶向性。這種簡單的“果糖封閉策略”有效減少了正常組織中NPs的分布，且明顯增加了NPs在實體瘤中的蓄積。這些生物相容性好的NPs為高侵襲性實體瘤及其轉移的臨床治療提供了一種有前景的方法。研究成果以題為“Enhanced Melanoma-Targeted Therapy by “Fru-Blocked” Phenyboronic Acid-Modifed MultiphaseAntimetastatic Micellar Nanoparticles”發布在國際著名期刊Adv. Sci.上。

【圖文導讀】

圖一、PLT NPs的制備和作用機制?

（a） PLT / DOX NPs制備和“果糖阻斷”策略的示意圖；

（b-c）對黑素瘤實體瘤和抑制肺轉移的PLT / DOX NP的示意圖。

圖二、NPs的表征和Fru、SA和PBA組合的研究

（a） PLT NPs的DLS和TEM圖；

（b） 不同濃度的PLT NPs培養的紅細胞的溶血率；

（c） 不同濃度的PLT NPs培養的紅細胞的溶血率的照片；

（d） 37^oC下PBS中LT / DOX NPs和PLT / DOX NPs的DOX釋放；

（e） 37^oC下50％FBS孵育24 h后NPs的血清穩定性；

（f） pH 7.4和pH 6.5 PBS中游離PSA與Fry的親和力；

（g） pH 7.4和pH 6.5 PBS中游離PSA與游離SA的親和力；

（h） PBA-Fru共軛物在不同時間點的穩定性測試。

圖三、不同制劑孵育后B16F10細胞的攝取?

（a） 與游離DOX、LT / DOX NPs、PLT / DOX NPs、PLT-BA / DOX NPs或PLT-SA / DOX NPs孵育2 h后，B16F10細胞的CLSM；

（b） 流式細胞（FACS）分析競爭性攝取測定的代表性直方圖；

（c） LT / DiD NPs、PLT / DiD NPs、PLT-Fru / DiD NPs和PLT-SA / DiD NPs分在pH 6.5和pH 7.4下孵育2 h后，B16F10細胞的定量攝取；

（d） PLT / DOX NPs孵育2 h后B16F10細胞的CLSM。

圖四、NPs對B16F10細胞體外遷移和侵襲的抑制及體內抗植入?

（a） PBS、LMWH、LT NPs、PLT NPs、LT / DOX NPs和PLT / DOX NPs分別與B16F10細胞孵育48 h后的圖；

（b） Free DOX、LMWH、LT NPs、PLT NPs、LT / DOX NPs和PLT / DOX NPs分別與B16F10細胞孵育24 h后的傷口愈合測定圖；

（c） Free DOX、LMWH、LT NPs、PLT NPs、LT / DOX NPs和PLT / DOX NPs分別與B16F10細胞孵育24 h后的傷口愈合測定的愈合率；

（d） PBS、LMWH、LT NPs、PLT NPs、LT / DOX NPs和PLT / DOX NPs分別與B16F10細胞孵育48 h后的定量分析；

（e） 與PBS、LMWH、LT NPs、PLT NPs、LT / DOX NPs和PLT / DOX NPs分別孵育30 h后, ELISA檢測B16F10細胞培養基中MMP-9；

（f） 體外附著于B16F10細胞的血小板熒光強度；

（g） 分別孵育后利用蛋白質印跡測試B16F10細胞中MMP-9的表達；

（h） 分別培養后利用蛋白質印跡檢測B16F10細胞培養基中的E-鈣粘蛋白和N-鈣粘蛋白的表達；

（i） 肺部冰凍切片的CLSM。

圖五、體內NPs的生物分布和轉移靶向能力?

（a） 全身施用負載DiD的NPs 4 h后，攜帶B16F10腫瘤的小鼠的體內圖像；

（b） 全身施用負載DiD的NPs 24 h后，荷瘤小鼠的腫瘤和器官的離體圖像；

（c） 半定量平均熒光強度顯示全身給藥24 h后攜帶DiD的NPs在B16F10荷瘤小鼠中的腫瘤和器官的分布；

（d） 半定量平均熒光強度顯示B16F10轉移模型小鼠在給予負載DiD的NPs 6 h后的體內圖像；

（e） 全身施用負載DiD的NPs 6 h后，B16F10轉移小鼠模型的肺離體圖像和半定量平均熒光強度結果；

（f） 全身施用負載DiD的NPs 6 h后，B16F10轉移模型小鼠的肺切片的CLSM；

（g） LT NPs、PLT NPs和PLT-Fru NPs在血液中的循環特征。

圖六、體內B16F10實體瘤治療

（a） 靜脈內注射PBS、free DOX、LT / DOX NPs、PLT / DOX NPs、 PLT-Fru / DOX NPs的C57BL / 6小鼠獲取B16F10腫瘤的圖像；

（b） 治療期間攜帶B16F10腫瘤的C57BL / 6小鼠的腫瘤體積變化；

（c） 獲取的B16F10腫瘤的重量；

（d） 不同DOX制劑處理的C57BL / 6小鼠中的DOX血漿濃度 與時間的關系；

（e） 蘇木精和H＆E測定的組織學分析和B16F10腫瘤的MMP-9染色的免疫組織化學分析。

圖七、體內抗腫瘤轉移治療?

（a） PBS、free LMWH、LT NPs或PLT NPs作用后，肺腫瘤后圖片；

（b） PBS、free LMWH、LT NPs或PLT NPs作用后，肺表面B16F10轉移的數量；

（c） PBS、free LMWH、LT NPs或PLT NPs靜脈注射預處理后B16F10轉移小鼠模型肺部的H＆E染色的組織學分析；

（d） PBS、free DOX、free LMWH、LT NPs、LT / DOX NPs或PLT / DOX NPs作用后，肺腫瘤后圖片；

（e） PBS、free DOX、free LMWH、LT NPs、LT / DOX NPs或PLT / DOX NPs作用后，肺表面B16F10轉移的數量；

（f） 靜脈內注射PBS、free DOX、free LMWH、LT NPs、LT / DOX NPs或PLT / DOX NPs處理后，B16F10轉移小鼠模型肺的H＆E染色的組織學分析。

【小結】

作者研究了腫瘤微環境可活化的PBA修飾的多位點抗腫瘤轉移膠束自傳遞系統，其可同時作為抗腫瘤轉移劑和納米載體用于治療實體腫瘤及其轉移。PLT / DOX NPs的組成包括抗腫瘤轉移活性成分LMWH、TOS和化療藥物DOX。 PLT NPs的親疏水片段可以抑制腫瘤細胞和血小板之間的粘附以及MMP-9的產生，從而抑制轉移級聯的不同位點。體內實驗表明載藥NPs和空白NPs均可有效減少肺轉移性結節的生成。這種低毒性且生物相容性良好的抗腫瘤轉移膠束或可作為術前術后的輔助療法，用以預防和治療多數經血的腫瘤轉移。此外，“果糖封閉”的PBA可以在腫瘤部位特異性暴露。這種策略有效地降低了PBA的脫靶效應，并進一步增強了腫瘤部位的NPs蓄積。因此，基于腫瘤微環境暴露的PBA的靶向策略有望用于治療高表達SA殘基的各類侵襲性腫瘤。

文獻鏈接：Enhanced Melanoma-Targeted Therapy by “Fru-Blocked”Phenyboronic Acid-Modifed Multiphase Antimetastatic Micellar Nanoparticles（Adv. Sci., 2018, DOI:10.1002/advs.201800229）

本文由材料人生物材料組小胖紙編譯。

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