新加坡國立大學劉斌教授Angew. Chem. Int. Ed.:吞噬體內細菌的光學診療

【引言】

一百多年來，人們對人類健康具有破壞性后果的致病性感染進行了廣泛的研究。抗擊細菌感染的一個主要挑戰是 無法在細菌感染的早期階段即治療最有效時以足夠的靈敏度和準確度檢測這些感染。目前用于細菌感染的診斷技術依賴于活組織的培養，組織學分析和外周血的取樣，其具有低靈敏度，耗時和處理復雜的特點。這些技術只能在出現明顯的全身性組織損傷時診斷細菌感染，這給治療帶來了挑戰。使問題復雜化的是，一些細菌能夠在宿主細胞內存活，這使得現有可用的治療無效，導致復發或慢性感染。由于檢測中的挑戰和對傳統抗微生物療法的高耐藥性，這些頑固性感染難以治療。為此，開發用于檢測和消除細胞內細菌的新策略是非常有吸引力的，這將對抗細菌感染的治療具有顯著影響。

使用常規方法進行有效的細胞內細菌檢測和消除的挑戰促進了基于納米醫學策略的發展。最近，抗體-抗生素綴合物，細胞介導的藥物遞送載體和甲氨蝶呤-肽綴合物，對于細胞內細菌感染治療是可行的。盡管這些方法可減少細胞內細菌，但仍需要更有效的試劑來有效地檢測和消除哺乳動物細胞中的致病細菌。一旦細菌被巨噬細胞吞噬，這些細菌中的一些能夠存在于不同的亞細胞位置，例如吞噬體和液泡。因此，需要具有成像和殺滅特性的新型造影劑，其能夠特異性地定位于具有細菌的亞細胞位點。免疫細胞，尤其是巨噬細胞，通常可以通過激活多種生物途徑快速響應細菌感染。因此，基于巨噬細胞的固有特征，用于細菌感染檢測和細胞內細菌消除的生物探針是很有希望的研究方向。

【成果簡介】

近日，新加坡國立大學劉斌教授課題組構建了基于AIEgen-肽的熒光生物探針（即PyTPE-CRP），其可特異性識別casp-1，用于細菌感染成像和細胞內細菌殺傷。PyTPE-CRP由兩個部分組成，即1）酶可裂解肽（NEAYVHDAP）作為響應部分，其可以通過casp-1在氨基酸Asp和Ala之間裂解；和2）AIE熒光團（即PyTPE），其在分子狀態下幾乎是無熒光的，但作為聚集體的形式則表現出強發射。 因為PyTPE-CRP具有良好的水溶性和在分子狀態下通過自由分子內旋轉的激子能量消耗, 因此PyTPE-CRP在水性介質中幾乎不發熒光。在細菌細胞感染巨噬細胞后，休眠的procaspase-1酶立即被蛋白水解切割激活，從而有效地切割了設計的肽底物。由此得到的PyTPE-CRP殘基自發地自組裝成聚集體并堆積在含有細菌的吞噬體上，導致PyTPE在巨噬細胞內熒光點亮。此外，該探針還可以作為產生ROS的光敏劑，細菌吞噬體中每單位面積的平均ROS指示劑熒光信號強度比細胞質高約2.7倍，從而誘導細胞內細菌殺滅效率。基于熒光點亮的策略，該探針具有選擇和靈敏診斷細菌感染的潛力，并且有望用于細胞內細菌的消除。該成果以題為“AIEgen-Peptide Conjugate: Phototheranostics for Phagosome-Entrapped Bacteria”發表在Angew. Chem. Int. Ed.上。

【圖文導讀】

Scheme 1.宏觀噬菌體介導的細胞內細菌感染的診斷和消除以及PyTPE-CRP的分子結構示意圖

Figure 1.探針分子的物理性質表征

A）PyTPE-N3（10μM）和PyTPE-CRP（10μM）在混合溶劑（DMSO/水）中的UV/vis吸收和光致發光（PL）光譜

B）含有ABDA（50μM）和用casp-1處理的PyTPE-CRP的混合物在白光照射（40mW/cm²）下不同時間的吸收光譜

C）與活化的casp-1孵育不同時間的PyTPE-CRP（10μM）的PL光譜

D）用活化的casp-1酶處理PyTPE-CRP后的TEM圖像

Figure 2.探針分子的溶液態響應

A）用活的或加熱失活的 S. aureus感染后，巨噬細胞內casp-1酶活化的動力學

B）用活細菌或加熱失活的細菌感染的巨噬細胞的細胞裂解物處理后，在650nm處PyTPE-CRP的相對熒光強度，沒有任何處理作為對照

C）與各種蛋白質孵育后在650nm處監測的PyTPE-CRP的相對熒光強度

D）與用不同濃度的casp-1特異性抑制劑（Ac-YVAD-cmk）預處理的感染性巨噬細胞的細胞裂解物溫育后PyTPE-CRP（10μM）的PL光譜

Figure 3.活細胞中細菌感染的延時熒光成像

Figure 4.細胞實驗

A）用S.aureus感染Raw 264.7巨噬細胞后60分鐘PyTPE-CRP定位的共聚焦圖像

B）含有S.aureus的吞噬體的PyTPE-CRP（紅色）和細菌DNA的熒光強度譜

C）在PyTPE-CRP存在下細菌感染后使用二氯熒光素二乙酸酯（DCF-DA）在巨噬細胞內檢測ROS的共聚焦圖像

D）含有S.aureus的吞噬體的DCF-DA和細菌DNA的熒光強度譜

E）在不同濃度的PyTPE-CRP存在下，在沒有和在40mW/cm²的功率密度下光照射10分鐘，RAW264.7巨噬細胞內的S. aureus存活情況，

F）在有無光照射（40mW/cm²,10分鐘）的的條件下，PyTPE-CRP對細胞外S. aureus的最小抑制濃度

G）在有無光照射下與不同濃度的探針一起孵育時，Raw 264.7巨噬細胞的存活率

Figure 5.細胞實驗

A）萬古霉素對不同感染時間的細胞內細菌的MIC

B）細胞內S. aureus對Raw 264.7細胞的細胞毒性

【小結】

在這個工作中，作者報告了一種具有聚集誘導發光（AIE）性質的生物探針，它可以通過動態過程檢測細菌感染并殺死巨噬細胞內存活的細菌，特別是通過受感染巨噬細胞中caspase-1活化的特異性分子探針和積累的殘留在含有細菌的吞噬體上，導致熒光信號點亮。此外，AIEgen可以作為光敏劑用于產生活性氧（ROS），并且細菌吞噬體中每單位面積的平均ROS指示劑熒光信號強度比細胞質中的高約2.7倍。反過來，這會以高效率和對巨噬細胞的最小細胞毒性誘導細菌殺死。我們設想這種特定的點亮生物探針可以為選擇性和靈敏的檢測和根除細胞內細菌感染提供新方法。

AIEgen-Peptide Conjugate: Phototheranostics for Phagosome-Entrapped Bacteria

(Angew. Chem. Int. Ed., 2019, DOI: 10.1002/anie.201906099)

課題組介紹：近年來，新加坡國立大學劉斌教授課題組主要研究和探索先進功能材料在生物醫學和清潔能源等領域中的應用。在生物醫學方面，致力于使用具有良好生物相容性的有機材料以實現對重要生物過程的高效便捷的示蹤以及對一些疾病非侵入性的治療；在清潔能源方面，主要設計合成高效的敏化劑和催化劑，用來將太陽能轉化成簡便易用的清潔能源。其成果多次發表在 Chem. Soc. Rev, Acc. Chem. Res, Nat. Commun, J. Am. Chem. Soc, Angew. Chem, Adv. Mater, Chem, ACS Nano, Adv. Funct. Mater, Chem. Mater 等國際一流期刊。

通訊作者簡介：劉斌，新加坡國立大學教授，化學與生物分子工程學院系主任，新加坡工程院院士，亞太材料科學院院士，英國皇家化學會會士。同時也是ACS Materials Letters, Advanced Materials and Advanced Functional Materials 等多個雜志的副主編及編委。致力于共軛聚合物發光材料、聚集誘導發光材料等在生物醫學及能源中的應用研究，其成果多次發表在國際一流期刊，h-因子高達85，連續多年榮獲科睿唯安 “高被引科學家” 稱號。其多項研究成果實現產業化并創立了LuminiCell公司。個人主頁: http://www.chbe.nus.edu.sg/faculty/cheliub

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