Adv. Mater.: 雙鎖納米粒子擾亂PD-1/PD-L1通路用于有效腫瘤免疫療法

金也 4年前 (2019-12-03) 4795瀏覽

【研究背景與研究進展】

CRISPR/CRISPR相關酶(Cas13a)可以在靶向識別后可通過“附帶效應”對腫瘤細胞進行選擇性殺傷，這使得其在腫瘤治療中具有廣闊的應用前景。然而，這種“附帶效應”并不特別針對腫瘤細胞，當在全身給藥時可能會引起安全問題。近日，南開大學劉陽教授，史林啟教授和天津醫科大學康春生教授（共同通訊作者）在國際著名期刊Adv. Mater.上發表相關研究文章，題目為“Dual-Locking Nanoparticles Disrupt the PD-1/PD-L1 Pathway for Efficient Cancer Immunotherapy”。

該研究描述了一種可限制CRISPR/Cas13a對腫瘤組織特異性激活的雙鎖納米顆粒（DLNP）。DLNP具有核-殼結構，其中CRISPR/Cas13a系統（質粒DNA，pDNA）被具有雙響應聚合物殼層包裹在核內。該聚合物層賦予DLNP在血液循環或正常組織中增強的穩定性，并促進CRISPR/Cas13a系統的細胞內化和進入腫瘤組織時基因編輯的激活。在仔細篩選和優化以程序性死亡配體1(PD-L1)為靶點的CRISPR RNA(crRNA)序列后，DLNP顯示了對B16F10荷瘤小鼠T細胞介導的抗腫瘤免疫的有效激活和免疫抑制腫瘤微環境（TME）的重塑，從而顯著抑制了腫瘤的生長，提高了荷瘤小鼠的生存率。

【圖文簡介】

圖1 DLNP在有效腫瘤免疫治療中的示意圖

類似于僅在兩個鎖都解鎖時才能打開的雙鎖保險箱，DLNP只能在低pHe和高H2O2濃度同時存在的微環境中釋放CRISPR / Cas13a系統。用這種基于CRISPR/Cas13a的PD-1/PD-L1通路靶向劑，DLNP有效地指導了T細胞介導的抗腫瘤免疫應答，并對免疫抑制的TME進行了重塑，使抗腫瘤效果和生存率顯著提高，且對小鼠的副作用極小。

圖2 DLNP、H2O2-NP和pH-NP的結構表征

a）雙鎖定納米顆粒（DLNP）的合成示意圖；

b）DLNP的尺寸分布和TEM圖像。標尺為200納米；

c）不同條件下DLNP、H2O2-NP和pH-NP的Zeta電位；

d）在37°C的FBS溶液中培養30分鐘后，DLNP、H2O2-NP和pH-NP的非特異性蛋白質吸附量；

e）不同條件下培養后DLNP的熒光光譜。PEI-PBA和PEI-HPBA用Cy5預標記；mPEG-b-PLys-SGD/CA和mPEG-b-PLys-SGD/SA用Cy3預標記。在515nm的激發波長下記錄光譜；

f）流式細胞儀定量分析DLNP，H2O2-NP和pH-NP的細胞內在化程度；

g）將DLNP（a），H2O2-NP（b）和pH-NP（c）在不同條件下與膠質瘤細胞共培養2 h的熒光顯微鏡圖片。細胞骨架F-肌動蛋白和細胞核分別用若丹明鬼筆環肽（橙色）和4，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）（藍色）復染色。 標尺為40 μm；

h）在含有0％或10％血清的培養基中，不同條件下用DLNP，H2O2-NP和pH-NP轉染的U87MG細胞的熒光顯微鏡圖像。

圖3 DLNP、H2O2-NP和pH-NP的生物功能表征

a–c）在不同條件下用DLNP處理的B16F10（a），GL261（b）和4T1（c）細胞的RNA變性凝膠。DLNP負載Cas13a/PD-L1；

d, e）在不同條件下用DLNP處理的B16F10（a），GL261和4T1（b）的細胞存活率。

圖4 DLNP的體內抗腫瘤作用

a-c）PBS，Null，PEI25k/pDNA，pH-NP，H2O2-NP和DLNP處理的小鼠的平均腫瘤生長動力學a），荷瘤小鼠的存活率b），以及小鼠的體重變化c）（n = 6）；

d-f）PBS，Null，PEI25k/pDNA，pH-NP，H2O2-NP和DLNP處理的小鼠的腫瘤中腫瘤內的TNF-α（a），IFN-γ（b）和IL-2（c）水平；

g）PBS，Null，PEI25k，pH-NP，H2O2-NP和DLNP處理的小鼠體內腫瘤內CD8+ T細胞的流式細胞統計分析；

h）PBS，Null，PEI25k，pH-NP，H2O2-NP和DLNP處理的小鼠體內腫瘤內CD8+ T細胞和CD4+ T細胞的流式細胞儀圖；

i）腫瘤的代表性免疫熒光圖像顯示CD8+ T細胞和CD4+ T細胞浸潤。標尺為100 μm。

圖5 TME中DLNP的免疫反應分析

a，d）PBS，Null，PEI25k，pH-NP，H2O2-NP和DLNP處理的小鼠體內腫瘤內M2細胞的流式細胞儀圖a），和統計結果d）；

b，e）PBS，Null，PEI25k，pH-NP，H2O2-NP和DLNP處理的小鼠體內腫瘤內M1細胞的流式細胞儀圖b），和統計結果e）；

c，f）PBS，Null，PEI25k，pH-NP，H2O2-NP和DLNP處理的小鼠體內腫瘤內髓系抑制細胞的流式細胞儀圖c），和統計結果f）；

g）PBS，Null，PEI25k/pDNA，pH-NP，H2O2-NP和DLNP處理的小鼠的腫瘤中腫瘤內的IL-12水平。

圖6 DLNP對CD8+T細胞缺失的B16F10荷瘤小鼠和4T1/B16F10共荷瘤小鼠體內抗腫瘤作用的研究

a-d） DLNP處理的正常荷瘤小鼠及CD8+阻斷荷瘤小鼠的平均腫瘤生長動力學a），存活率b），以及小鼠的體重變化d）；

c）腫瘤的代表性免疫熒光圖像顯示CD8 + T細胞和CD4 + T細胞浸潤。 比例尺為100 μm;

e）4T1（右）和B16F10（左）共育C57BL/6小鼠示意圖；

f）共負載小鼠的腫瘤生長曲線；

g）分別用PBS和DLNP處理的小鼠4T1和B16F10腫瘤中CD8+T細胞和CD4+T細胞的代表性流式細胞儀圖。

【小結】

該研究開發了一種雙鎖納米粒子，它可以限制CRISPR/Cas13a在腫瘤組織中的激活。采用聚乙二醇（PEG）為基的聚合物外殼，經靜脈注射后，DLNP具有良好的血液循環穩定性。更重要的是，DLNP只能在低ph和高H2O2濃度的微環境中釋放CRISPR/Cas13a系統。這一特性顯著改善了CRISPR/Cas13a系統在腫瘤部位的富集，提高了CRISPR/Cas13a系統的基因編輯效率，減少了CRISPR/Cas13a在正常組織中的意外激活所引起的副作用。通過DLNP對CRISPR/Cas13a活化的精確控制，首次實現了CRISPR/Cas13a系統在腫瘤免疫治療中的應用。

全身給藥DLNP/Cas13a/PD-L1后，B16F10荷瘤小鼠的腫瘤生長速率顯著減緩，生存率明顯提高。因此，我們的研究為精確控制CRISPR/Cas13a系統激活抑制腫瘤生長提供了一種安全有效的方法。考慮到免疫效應細胞抑制途徑的多樣性，可以通過替換特異性crRNA的靶向基因而進行的進一步開發可能使DLNP成為快速開發安全有效的癌癥免疫療法的通用平臺。

文獻鏈接：Dual-Locking Nanoparticles Disrupt the PD-1/PD-L1 Pathway for Efficient Cancer Immunotherapy, 2019, Adv. Mater. DOI: 10.1002/adma.201905751.

團隊介紹：

劉陽博士，研究員，2006年畢業于南開大學化學專業，獲學士學位。同年考入南開大學高分子化學研究所，2011年畢業，獲高分子化學博士學位。畢業后赴美在加州大學洛杉磯分校化學工程與分子生物工程系深造，于2016年獲化學工程博士學位。主要從事高分子納米藥物載體及生物活性納米材料的研究。代表性研究成果包括：建立了納米復合酶的可控構建方法，實現了多種蛋白體內和胞內的協同遞送；建立了多種可動態適應體內環境的納米載體，顯著提升了藥物對腫瘤的富集效率；提出通過納米-生物界面相互作用直接干預生物過程的新思路，構建多種具有生物活性表面的納米顆粒，為癌癥免疫治療及阿爾茲海默癥的治療提供了全新的思路。相關成果在Nat. Nanotechnol. (1), Adv. Mater. (3), Nat. Commun. (1), Angew. Chem. Int. Ed. (2), Nano Lett. (2), Adv. Sci. (1) 等期刊發表論文40余篇。2016年入選中組部“青年千人”，2018年以首席科學家身份承擔科技部重點研發計劃“納米科技”青年項目。

推薦文獻：

  1. O. Abudayyeh, J. S. Gootenberg, S. Konermann, J. Joung, I. M. Slaymaker, D. B. Cox, S. Shmakov, K. S. Makarova, E. Semenova, L. Minakhin, K. Severinov, A. Regev, E. S. Lander, E. V. Koonin, F. Zhang, Science 2016, 353, aaf5573;
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  3. O. Abudayyeh, J. S. Gootenberg, P. Essletzbichler, S. Han, J. Joung, J. J. Belanto, V. Verdine, D. B. T. Cox, M. J. Kellner, A. Regev, E. S. Lander, D. F. Voytas, A. Y. Ting, F. Zhang, Nature 2017, 550, 280;
  4. J. Knott, A. East-Seletsky, J. C. Cofsky, J. M. Holton, E. Charles, M. R. O’Connell, J. A. Doudna, Nat. Struct. Mol. Biol. 2017, 24, 825;
  5. S. Gootenberg, O. O. Abudayyeh, J. W. Lee, P. Essletzbichler, A. J. Dy, J. Joung, V. Verdine, N. Donghia, N. M. Daringer, C. A. Freije, C. Myhrvold, R. P. Bhattacharyya, J. Livny, A. Regev, E. V. Koonin, D. T. Hung, P. C. Sabeti, J. J. Collins, F. Zhang, Science 2017, 356, 438;
  6. Wang, X. Liu, J. Zhou, C. Yang, G. Wang, Y. Tan, Y. Wu, S. Zhang, K. Yi, C. Kang, Adv. Sci. 2019, 6, 1901299.
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