【NS精讀】水凝膠如何變得更像生物組織？——增加材料維度

背景

水凝膠是一種含水量豐富的聚合物網絡，能夠模擬細胞外基質環境，是常見的細胞體外培養和實驗材料。然而，天然的細胞外基質不僅具有三維結構，還表現出隨時空維度進行變化的動態特性，是一種名副其實的“四維”材料。作為其人工模擬物，水凝膠的“使命”就是要無限接近于細胞外基質，因此創造具有可時空操控的四維水凝膠一直是人們追求的目標。

圖1?細胞外基質（左）和水凝膠（右）（來源：左-網絡，右-Materials Views）

實際上，目前已經有許多先進的生物材料實現了隨時間（第四維度）變化的特性，例如對環境信號敏感的刺激響應材料、形狀記憶聚合物以及可降解材料等。近年來的研究也逐漸實現了在水凝膠中對具有生物活性的小分子或者簡單比較簡單的多肽進行圖案化，并成功引導細胞完成諸如粘附、擴散之類的簡單功能。然而，為了使水凝膠更接近于細胞外基質從而推進其在藥物遞送、細胞行為研究等領域的發展，必須賦予水凝膠完成復雜細胞功能的能力。因此，光是鏈接多肽或者小分子是不夠的，更需要鍵連氨基酸序列完整的蛋白質（全長蛋白質）。然而，對于此類結構復雜的蛋白質，如何在水凝膠中保持活性并實現第四維度的控制目前來說都是一項巨大但誘人的挑戰。美國華盛頓大學的DeForest（通訊作者）團隊近期發展了一種帶有位點特異性修飾蛋白質的水凝膠，在保證全長蛋白質活性的同時還能實現四維光圖案化。

圖2?Nature Materials刊發了DeForest關于四維水凝膠的最新工作

最大限度地保留全長蛋白質的生物活性

水凝膠技術發展至今之所以還未實現對全長蛋白質的整合和功能控制，是因為全長蛋白質結構復雜、十分脆弱，需要利用合適化學方法和精準的位點改性將其錨定到水凝膠的聚合物網絡中。更重要的是，鍵連錨定之后的水凝膠必須保持穩定性和活性，以便其發揮正常的生物功能。為了達到這些要求，水凝膠與蛋白質之間的錨定必須是可控的——對蛋白質的鍵連修飾必須是特異性的，不應破壞蛋白質的結構和活性。然而，現有的方法是利用氨基酸殘基上的巰基或者氨基通過非特異性反應將具有鍵連活性的基團修飾到蛋白質上，容易形成多類型的改性物，導致蛋白質去折疊并失去活性。

圖3 STEPL原理示意圖（a）；五種帶有活性基團的聚甘氨酸探針分子（b）

為了解決這一問題，DeForest等人采用新型的分選酶標記增強型蛋白質連接技術（STEPL）來一步實現蛋白質的功能化改性和純化。在STEPL中，分選酶（Sortase A）全通過特異性識別全長蛋白質中的目標氨基酸分選酶來融合形成單一蛋白質構造，之后在鈣離子的介導下，帶有氨基端和活性基團（如醛基）的探針分子（如聚甘氨酸）親核取代分選酶形成帶有活性位點的改造蛋白質，游離的分選酶則被層析柱吸附分離，使得蛋白質得到純化（圖3）。由于利用STEPL，研究人員以6種蛋白質（EGFP、mCherry、mCerulean、EGF、bla、FGF）和5種聚甘氨酸類功能探針分子一共合成了30種高純度的帶活性位點蛋白質。

圖4?STEPL改造和NHS酯化改造的六種蛋白質的活性比較

成功合成帶活性位點蛋白質后，研究人員檢測了這種蛋白質的活性是否得到了保留。如圖4所示，在六種蛋白質中，熒光檢測表明，經過STEPL改造的熒光蛋白EGFP、mCherry以及mCerulean的熒光活性與未改造蛋白質幾乎沒有差別。比色檢測則發現改造bla水解頭孢菌素的能力也沒有明顯減弱。而改造EGF和FGF對細胞增殖的促進作用也得到了保留。而與STEPL相比，傳統的N-羥基丁二酰亞胺（NHS）酯化改造蛋白質的方法則對蛋白質活性表現出了劑量依賴的減弱作用。

在水凝膠中固定全長蛋白質

確定了改造蛋白質的活性后，需要解決在水凝膠中可控錨定全長蛋白質的問題。研究人員首先利用應變促進的疊氮-炔烴環加成作用（SPAAC）合成了生物相容性良好的聚乙二醇（PEG）水凝膠。如圖5a所示，這一水凝膠骨架聚合物上包含了基于羰基化合物（NIPPOC）光囚禁的烷氧基胺，在紫外輻照下，NIPPOC斷鍵烷氧基胺被釋放，而改造蛋白質取而代之與骨架聚合物進行肟鍵連接（oxime ligation）。由于需要檢測水凝膠的圖案化過程，因此研究人員利用具有熒光活性的改造EGFP（EGFP-CHO）作為模型蛋白。

圖5 在水凝膠中實現改造蛋白質的光圖案化

在水凝膠中進行全長蛋白質圖案化

之后，在光刻技術的幫助下，研究人員實現了凝膠厚度的掩膜形狀可控化（圖5a-f）。由于凝膠厚度對光強的影響，NIPPOC的光斷鍵行為呈現出梯度變化的趨勢，因此可以繼而控制EGFP-CHO與水凝膠的連接，從而控制蛋白質的定位和濃度。在實現了蛋白質固定的可控三維圖案化后，文章還研究了光釋放蛋白質的可控圖案化。首先，分選改造的mCherry蛋白質被均一地鍵連到水凝膠中，在光輻照下，蛋白質斷鍵釋放并被擴散出水凝膠，也能形成基于掩膜光刻技術的圖案化。以上的過程實現了靜態的三維圖案化，而通過多種紫外波長的光輻照，不同的改造蛋白質經過多個釋放-固定過程，則可以控制三維圖案化隨著時間進行復雜變化——即實現四維的動態圖案化（圖6）。

圖6 含有多種改造蛋白質的水凝膠在迭代的釋放-固定過程中實現四維動態圖案化

含有全長蛋白質的水凝膠引導復雜的細胞功能

在證明了水凝膠中的蛋白質可以在時空四個維度上被控制行為之后，研究人員終于著手檢驗是否可以通過控制蛋白質來控制復雜細胞功能的控制。首先，為了對引導細胞功能進行可視化，研究人員利用STEPL合成了EGFP-EGF改造蛋白質。之后，研究人員將具有熒光活性的EGFP-EGF鏈接到水凝膠中，通過動態EGF刺激對EGF的促增殖活性進行圖案化。作為模型細胞，A431細胞被固定到水凝膠上。如圖7a和b所示，EGFP-EGF能夠促進細胞的增殖，特別是在圖案化區域，細胞的密度是非圖案化區域的兩倍多，顯然證明了水凝膠圖案化能夠控制細胞的增殖這一復雜的細胞功能。而圖7c和d則表明，研究人員可以光釋放蛋白質至指定區域（如細胞的一側），表明在動態水凝膠中對細胞功能的控制可以達到單細胞的水平。

圖7 利用EGFP-EGF改造蛋白在水凝膠中控制細胞增殖

參考文獻：

Bioactive site-specifically modified proteins for?4D patterning of gel biomaterials. Nature Materials, 2019, 18, 1005-1014.

文獻鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41563-019-0367-7

本文由nanoCJ供稿。

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