Advanced Materials：細菌分離和檢測一體化的多級環形功能化碳納米管陣列器件

一、【導讀】

細菌污染及其產生的相關毒素可導致各種疾病與并發癥，如傷口感染、食源性疾病、痢疾、敗血癥等，而快速準確的細菌檢測是避免細菌污染和識別細菌來源的關鍵。然而，來源和成分復雜的各類生物樣品固有的低病原體濃度和高雜質濃度為精準高效的細菌檢測提出了巨大的挑戰。為了解決樣品中病原體濃度低的問題，目前細菌檢測方法通常對樣品進行額外的病原體分離富集和擴增的步驟。但是這種獨立于檢測步驟之外的預處理步驟存在耗時長、分析樣本量小、以及需要專業器件和熟練人員等的制約，始終無法滿足在突發公共衛生危機情況下對病原體的快速、現場和實時監測的需求。

近年來，具有超高孔隙度（>99%）和良好滲透率（1×10^-13 m²）的森林狀碳納米管陣列（CNTA）在細菌及其生物標志物的快速高效分離方面顯示出了巨大的潛力。利用CNTA的三維納米結構并用靶向分子對其進行功能化，可以實現在非牛頓流體樣品中對粒度分布在0.04-100 μm之間的分析物的有效分離和特異性捕獲富集。盡管已有研究在基于CNTA的微流控芯片中實現了對細胞、細菌、病毒等的高效分離，但其處理樣本體積較小且尚未能實現集成分離和檢測一體化的技術挑戰。

二、【成果掠影】

近日，廈門大學材料學院李立煌博士等在任磊教授和王苗助理教授的指導下報道了一種基于適配體功能化的多級環形碳納米管陣列器件。該器件在基于尺寸分離機制與適配體特異性捕獲機制的共同作用下，實現了對復雜生物樣品中的細菌及其生物標志物的快速分離和多靶標定量檢測的一體化集成。并通過對離心力輔助調節CNTA內液體樣品的流體動力學進行數值仿真計算研究，優化了該器件快速分離雜質和捕獲生物標志物的性能（1 mL樣品的處理時間為2.5 s），可以適用于各種不同體積的液體樣品的快速檢測分析（總體檢測時間在30 min以內）。該工作以金黃色葡萄球菌及其外泌囊泡和腸毒素蛋白的檢測為實例，展現了該集成化器件在多靶標病原體快速檢測方面具備的寬檢測限（10¹ ~ 10⁷ CFU/mL, R² = 0.997）、高靈敏度（LOD = 1.7 CFU/mL）、高特異性等優勢。通過兔菌血癥模型的檢測分析中表現出的高效精確的檢測結果，進一步表明該器件在復雜生物樣品病原體檢測中的巨大實際應用潛力。此外，該器件開放式的設計允許人們根據不同的應用場景對器件的檢測層數和識別靶標進行定制，在突發傳染病的診斷與治療、感染源追蹤、環境監測等領域具有重要的應用價值。該成果發表于材料領域國際頂級期刊Advanced Materials上。

三、【核心創新點】

其研究亮點在于利用CNTA尺寸分離機制、適配體識別機制以及離心力輔助流體流動機制設計了對病原體的快速精準分離和富集模塊，并通過便攜式拉曼檢測模塊實現了原位快速檢測的集成。復雜生物樣品無需任何預處理可以直接進行加樣，在離心力的輔助下樣品一次通過三種不同表面修飾的CNTA，其中大尺寸物質如細菌、細胞等在第一層環形CNTA中被濾出，小尺寸物質如外泌囊泡、蛋白、無機鹽等可以在CNTA中順暢流動。器件后續幾層環形CNTA可以根據檢測需求進行相應適配體修飾的定制，以實現對特定生物標志物的捕獲。在各個環形檢測層上被分別分離和富集的病原體通過適配體修飾的表面增強拉曼散射（SERS）標簽進行二次捕獲，形成三明治SERS檢測模型用于原位快速拉曼信號的檢測。

通過流體動力學數值仿真分析，團隊系統性地探究了離心力作用下器件中液體樣品的流動性以及微觀粒子與CNTA的相互作用關系。通過多孔介質兩相流的數值模擬，團隊引入離心力來改善樣品在器件中流動性，克服了樣品在器件中非均勻流動甚至外溢的問題，在保證病原體分離效率的同時提高樣品添加速率以便于縮短大體積樣品的總體檢測時間。通過流體動力學與粒子跟蹤的數值模擬，團隊揭示了微觀粒子在流經CNTA過程中由于近表面效應增加了流體中粒子與適配體修飾的CNTA的接觸時間，粒子在陣列中的滯留時間的延長為提高適配體的特異性結合效率提供了條件。

以金黃色葡萄球菌及其外泌囊泡和腸毒素蛋白的檢測為實例，團隊建立細菌濃度與SERS信號強度之間的線性關系，結果表明在10¹ - 10⁶ CFU/mL濃度范圍內，基于不同生物標志物的SERS信號強度均與細菌濃度呈現出良好的線性關系。在使用含有金黃色葡萄球菌的兔血樣本檢測中，對各個環形檢測層上36個取樣點的SERS檢測信號熱圖都表現出均勻的強度分布和低信噪比，且該結果與傳統血培養計數法的結果無明顯差異，表明該器件定量檢測的可靠性。團隊以大腸桿菌、羅伊氏乳桿菌和銅綠假單胞菌為對照，表明該器件具有良好的特異性。此外，通過對兔菌血癥模型的外周血液樣本檢測表明該器件可以快速有效地鑒定出兔外周血樣品中中低濃度細菌，表明了其在菌血癥、膿毒癥等嚴重細菌感染疾病診斷中的實際應用潛力。

四、【數據概覽】

圖1、集分離和檢測一體化的多級環形功能化碳納米管陣列器件示意圖

圖2 碳納米管陣列器件和表面增強拉曼散射標簽的制備。（A）多級環形功能碳納米管陣列器件制備示意圖；（B）碳納米管和（C）經層層自組裝修飾的碳納米管電鏡圖；（D）層層自組裝修飾的碳納米管陣列的水接觸角；（E）層層自組裝修飾的碳納米管陣列的紅外光譜圖；（F）熒光標記適配體功能化修飾的碳納米管陣列三維共聚焦圖像；（G）基于金納米棒的表面增強拉曼散射標簽的透射電鏡圖；（H）聚集狀態下表面增強拉曼散射標簽的拉曼增強因子模擬；（I）表面增強拉曼散射標簽的拉曼光譜圖。

功能化CNTA的制備方法如圖2A所示，超疏水的CNTA通過層層自組裝（LBL）進行親水性修飾，并以生物素-親和素系統介導了CNTA與不同適配體的功能化。化學氣相沉積制備的CNTA呈現出典型的森林狀結構（圖2B），經功能化后其表面組裝了厚度約為3 nm的聚合物層（圖2C）。表面修飾后的CNTA的親水性顯著提高（圖2D），從而便于液體樣品的快速流動。紅外光譜（圖2E）和激光共聚焦熒光分布（圖2F）進一步表明CNTA成功實現了均勻的表面功能化修飾。由于在CNTA表面引入了豐富的適配體，該器件表現出對外泌囊泡和腸毒素的特異性捕獲能力。為了獲得高靈敏度的檢測信號，制備了基于金納米棒的SERS標簽（圖2G），并通過數值仿真計算了其聚集狀態下的最大電場增強（EFmax）可達6.82 × 10⁸（圖2H）。位于SERS標簽聚集體產生的熱點區域內的DTNB分子提供了金黃色葡萄球菌表面蛋白A靶向的SERS標簽（SSA-SERS標簽）和金黃色葡萄球菌腸毒素蛋白靶向的SERS標簽（SEA-SERS標簽）的高強度SERS信號，為后續的高靈敏度定量測定提供了基礎（圖2I）。

圖3、離心力輔助的流體動力學模擬。不同轉速下多級功能化碳納米管陣列器件的流體形態（A）示意圖和（B）實時照片；（C）不同轉速對應壓力下的多孔介質兩相流仿真計算；（D）液相填充碳納米管陣列所需的時間與壓力的關系；（E）碳納米管陣列內的液體流速分布；（F）單根碳納米管表面液體流速；（G）微觀粒子流經碳納米管陣列的軌跡仿真；（H）流體與碳納米管陣列相互作用下微觀粒子的滯留時間。

保證液體樣品在器件中的快速均勻流動是提高細菌分離效率的前提。雖然功能化后的CNTA具有良好的親水性和滲透性，但當樣品添加速率較高時，由于液體的表面張力，液體更容易從器件中溢出。為了克服液體溢出的問題，團隊提出了通過離心力輔助增加液體流動性的解決方案（圖3A）。利用器件在旋轉時產生的離心力，液體樣品可以以較高的注射速度均勻地流過CNTA而不引起外溢（圖3B）。進一步地，通過流體動力學數值仿真計算，系統性地探究了離心力作用下器件中液體樣品的流動性（圖3C-D）以及微觀粒子與CNTA的相互作用（圖3E-H）。結果表明，在離心力的輔助下樣品在CNTA中的流動速度顯著加快避免了液體的外溢。此外，CNTA近表面流體速度降低的效應有助于增加流體中粒子與CNTA表面相互作用的相對時間，這種粒子滯留時間的延長為提高靶分子的特異性捕獲效率提供了條件。

圖4、金黃色葡萄球菌及其外泌囊泡和腸毒素分離和檢測性能的集成。（A）基于尺寸分離的碳納米管陣列工作示意圖；（B）分離富集在碳納米管陣列中的金黃色葡萄球菌的掃描電鏡圖；（C）器件在不同轉速下對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、兔紅細胞、胎牛血清蛋白和葡萄糖的過濾性能；（D）表面增強拉曼散射標簽介導的拉曼信號檢測示意圖；（E）表面增強拉曼散射標簽對分離富集在碳納米管陣列中的金黃色葡萄球菌進行二次捕獲的掃描電鏡圖；一系列細菌濃度梯度下對（F）金黃色葡萄球菌、（G）外泌囊泡和（H）腸毒素的拉曼光譜圖；（I）多級環形功能化碳納米管陣列器件對金黃色葡萄球菌、外泌囊泡和腸毒素檢測信號的線性擬合。

該器件通過CNTA尺寸分離機制和修飾適配體的特異性捕獲機制來實現細菌及其生物標記物的分離富集，進而在器件上實現原位快速的拉曼檢測模塊的集成。在第一層環形CNTA上，大尺寸物質如細菌、細胞等被濾出，小尺寸物質如外泌囊泡、蛋白等可以順暢流動到相應的適配體修飾CNTA上被捕獲（圖4A-C）。分離富集在CNTA上的細菌生物標記物與適配體修飾的SERS標簽實現二次結合形成三明治SERS檢測模型（圖4D-E）。以金黃色葡萄球菌為模型菌，團隊建立了細菌濃度與SERS信號強度之間的線性關系（圖4F-I）。結果表明在10¹ - 10⁶ CFU/mL濃度范圍內，基于不同生物標志物的SERS信號強度均與生物標志物濃度呈良好的線性關系，最低檢測限為1.7 CFU/mL。

圖5、多級環形功能化碳納米管陣列器件對復雜生物樣品的檢測性能。（A）在器件環形區域中各選擇36個隨機檢測點的檢測信號強度熱圖；（B）使用器件和傳統血培養計算法對含菌的兔外周血樣本的檢測結果；（C）多級環形功能化碳納米管陣列器件的特異性；（D）兔菌血癥模型和正常兔的血液檢測結果。

為了進一步驗證該器件的實用性和可靠性，團隊使用該器件對未經任何前處理的血液樣本進行了加標檢測，器件上三層標志物的SERS檢測信號熱圖呈現出均勻的強度分布和低信噪比（圖5A），表明定量檢測的可靠性。根據濃度的線性關系將SERS信號強度轉換為細菌濃度后，該器件的三層獨立檢測結果與傳統血培養計數法無明顯差異（圖5B）。以大腸桿菌、羅伊氏乳桿菌和銅綠假單胞菌為對照，團隊考察了該器件的特異性（圖5C）。此外，通過兔菌血癥模型與正常兔的外周血檢查結果表明該器件可以快速有效地診斷出菌血癥以及感染的細菌種類（圖5D），表明了其在復雜生物樣品檢測中的巨大潛力。

五、【成果啟示】

該團隊的研究成果為高效檢測各類復雜生物樣品中病原體含量和種類的檢測提供了全新的解決方案，在快速、高靈敏度、多標記和定量的病原體實時檢測技術方面取得了重要進展。該研究不僅為基于CNTA的快速樣品分離富集應用提供了理論指導，也為各種病原體快速痕量檢測以及大體積樣本實時監測等方面提供了技術思路。

文章信息：

Lihuang Li, Jialing Zhang, Zhengqi Jiao, Xi Zhou, Lei Ren, Miao Wang. Seamless Integration of Rapid Separation and Ultra-Sensitive Detection for Complex Biological Samples using Multistage Annular Functionalized Carbon Nanotube Arrays. Advanced Materials 2024, 2312518. DOI: 10.1002/adma.202312518

文章鏈接：

https://doi.org/10.1002/adma.202312518

作者簡介：

李立煌，廈門大學廈門大學材料學院博士研究生，2019年于廈門大學獲得碩士學位，研究方向主要為數值仿真、生物傳感器、仿生器件等。

王苗，廈門大學助理教授，福建省高層次人才，中國化學快報《Chinese Chemical Letters》青年編委。已發表學術論文57篇，其中以第一/通訊作者在Adv. Mater., Joule, JACS, Nano Lett., ACS Nano, Adv. Funct. Mater.等高水平學術期刊上發表論文35篇，合作發表Nature，Nat. Commun., Sci. Adv.等頂級期刊論文；主持國家自然科學基金、福建省自然科學基金及高校-企業合作橫向課題等共計7項；授權專利13項；曾入圍MINE2020青年科學家候選人；2023年獲得第十五屆福建省自然科學優秀學術論文。

任磊，廈門大學教授、博士生導師，《Journal of Functional Biomaterials》、《Smart Materials in Medicine》等期刊編輯。近年來任磊教授長期堅持致力于從事納米靶向藥物、納米免疫制劑、納米材料合成、生物傳感器和仿生器件等方面的研究工作。目前已主持多項國家自然科學基金等國家級項目，并與多家生物醫藥企業開展轉化合作研究，已發表學術論文170余篇；獲授權中國發明專利20余項。