Adv. Mater.：生物結構的懸浮制造

【引言】

長久以來，研究人員試圖使用與細胞外基質(ECM)具有結構相似性的分離細胞和聚合物水凝膠的組合來重現組織結構。現有的凝膠澆鑄方法只能實現宏觀幾何控制。加層制造(ALM)可創造出更復雜的結構，實現對整個結構中的細胞和其它重要組分分布的控制。但軟質材料的ALM表現出相對低的復雜性。使用懸浮介質的加層制造，可得到復雜的結構，但無法共沉積多種細胞類型，且由于懸浮介質難以從成品部件中完全去除，將不適于臨床使用。

懸浮制造法可制備具有嚴格形態定義、機械性能和化學性能的復雜軟結構。凝膠顆粒之間的強表面相互作用在其緊密接觸時形成短程粘連，導致糊狀材料變稠。顆粒之間形成的相互作用允許顆粒材料支撐類似密度(或更高)的第二相。由于凝膠顆粒是離散實體，不污染所制造樣品的表面。使用顆粒狀凝膠作為懸浮劑，以類似于發育中的胎兒在羊水中懸浮的方式支撐樣品。這種方法可用于生產復雜的載有細胞的結構。

【成果簡介】

近日，英國伯明翰大學Liam M. Grover和英國哈德爾菲斯大學Alan M. Smith (共同通訊作者)等人使用在室溫下穩定的自愈合凝膠顆粒(通常稱為流體或剪切凝膠)作為“床體”，為整個部件提供支撐。通過膠凝材料分散到支撐流體凝膠顆粒之間的間隙中形成最終結構。實現了相對復雜的結構化，同時提供足夠的支撐以防止結構在其自身重量下塌陷。形成的支架結構，可通過溫和地施加剪切移除支撐相，同時保持培養物中人原代軟骨細胞群的存活力。懸浮制造法可以形成具有仿天然軟骨環境的各向異性機械性能的復合水凝膠結構。這些支架可以用于生產骨軟骨塞以應對逐年增加的全層軟骨缺損疾病。該成果以“Suspended Manufacture of Biological Structures”為題于2017年2月1日發表在期刊Advanced Materials上。

【圖文導讀】

圖1：使用懸浮沉積方法制造3D軟固體結構示意圖

(A) 在容器中產生“流體-凝膠”支撐基質

(B) 將第二相擠入顆粒床中

(C) 可自愈合的流體凝膠，在交聯過程中支撐凝膠結構

(D) 一旦交聯，可以將物體從顆粒床上移除

(E) 制造裝載有羥基磷灰石納米顆粒的簡單螺旋，并使用micro-CT成像

圖2：骨軟骨缺陷的模擬結構及細胞組織支架的制備

將裝載有原代人軟骨細胞的冷凝膠基質通過內徑為337μm的皮下注射針擠入到“流體-凝膠”結構中，維持整個結構中的細胞活力。針內徑的增加導致分辨率降低(中心，頂部)，基質(中心，底部)的粘度降低。從這些實驗中得出，為了制造軟骨塞，設置流體粘度為0.75Pa s(在1s^-1的剪切速率下)，針直徑為337μm。該軟骨塞的計算機模型(右欄)由臨床醫生對鉆出缺陷的組織進行CT掃描產生。 所得模型用于制造具有合適的軟骨和軟骨下厚度的軟骨塞以適合組織缺陷。

圖3：3D骨軟骨缺損模型的機械性能、生物活性及表型研究

(A) 在用刀片切割并使用流變儀進行機械表征之前，對使用懸浮制造法制備的樣品進行培養

(B) 構建體的儲能模量從結構的核心“骨”區域(區域C和D)到軟骨區域(區域A和B)呈現出顯著減少的趨勢。在天然組織中，儲能模量從透明軟骨(區域A)通過骨軟骨界面(區域B)到軟骨下骨(區域C和D)逐漸增加。該力學數據反映了在天然組織中觀察到的趨勢，這表明，有可能在限定幾何形狀的同時確定所得結構表現出的機械性能 ??[注：將構建體切成A、B、C和D四個區域，并在每個部分上進行應力掃描以確定機械強度和彈性]

(C) 應力松弛測量顯示加入羥基磷灰石的吉蘭糖膠(GG + HAp)會比單一的吉蘭糖膠(GG)表現出更快的應力松弛響應? ?[注：更快地應力松弛響應會更大程度的促進礦化]

(D) 構建體在人組織缺陷內培養4周后除去，回收軟骨(CH)、骨界面(IF)和骨區域(OB)內的細胞用于分離RNA，通過定時定量PCR(qRT-PCR)分析mRNA。支架軟骨部分的細胞表達出最高水平的膠原II和聚集蛋白聚糖(ACAN)，骨區域表達出更多的膠原IA1。這表明沉積到離散區域的細胞維持生存力且維持其表型

(E) 熒光免疫組織化學(IHC) (DAPI(苯基吲哚)=藍色，聚集蛋白聚糖=綠色)顯示出，在構建體的軟骨區域中產生了聚集蛋白聚糖 ?[注：軟骨形成的標志物]

【小結】

通過將凝膠聚合物擠入基于顆粒的支撐基質來制造相對復雜的軟固體結構。可實現軟固體材料的結構化，使它們在微尺度上表現出不同的化學和物理性質。懸浮制造可以重現由CT掃描定義的骨軟骨區域的結構。3D打印的結構在四周培養期內保持其形態和機械穩定性，固定化細胞保持其表型。研究結果表明這種生產3D組織樣結構的新方法在再生和研究復雜組織結構及界面等領域具有廣闊的發展前景。

文獻鏈接：Suspended Manufacture of Biological Structures (Adv. Mater., 2017, DOI: 10.1002/adma.201605594)

本文由材料人生物材料組白皓供稿，材料牛編輯整理。

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