學術干貨│熒光光譜入門(二)：熒光光譜儀和熒光分析新技術

一、熒光光譜儀

1. 熒光光譜儀結構

熒光光譜儀(熒光分光光度計)是測量熒光的儀器，主要由光源、激發單色器、樣品池、發射單色器和檢測器等組成。

圖1 熒光光譜儀及其主要組件示意圖

(1)光源

由于熒光樣品的熒光強度與激發光的強度成正比，因此，作為一種理想的激發光源應具備：足夠的強度、在所需光譜范圍內有連續的光譜、強度與波長無關(即光源的輸出是連續平滑等強度的輻射)、穩定的光強。常用的光源主要有氙燈和激光器。

(2)單色器

熒光光譜儀中單色器一般為光柵或濾光片，需要兩個，一個用于選擇激發光波長(激發單色器)，一個用于分離選擇熒光發射波長(發射單色器)。

(3)樣品池

熒光光譜儀用的樣品池材料要求無熒光發射，通常為熔融石英，樣品池四壁均光潔透明。對于固體樣品，通常固定在樣品夾的表面。

(4)檢測器

熒光的強度通常比較弱，因此要求檢測器有較高的靈敏度。一般采用光電倍增管(PMT)，二極管陣列檢測器、電荷耦合裝置以及光子計數器等高功能檢測器也已得到應用。

2. 熒光光譜儀的光譜分辨率

光譜分辨率是指把光譜特征、譜帶分解成為分離成分的能力。分析人員需要什么樣的光譜分辨率取決于所面對的具體問題。一般，用于基本樣品識別的常規分析只需要低/中光譜分辨率。對于樣品峰位移動或受外在環境因素影響而引起峰位移動的表征則通常需要高分辨率，因為這些現象在熒光光譜上僅僅表現為非常細微的變化，在低分辨率實驗中觀察不到。

3. 熒光光譜儀中的單光子計數技術

單光子計數技術是利用在弱光下PMT輸出信號自然離散化的特點，采用放大技術和精密的脈沖幅度甄別技術以及數字計數技術，可把淹沒在北京噪聲中的熒光信號提取出來。當熒光到達PMT的光電子陰極時，每個入射光子以一定的概率(即量子效率)使光陰極發射一個電子。這個光電子經倍增系統的倍增最后在陽極回路中形成一個電流脈沖，通過負載電阻形成一個脈沖電壓，這個脈沖稱為單光子脈沖，而“單光子計數技術”可以測得低至單個不重疊的光子能量脈沖，通過精密的鑒別手段進行工作，從而實現探測“單光子”級別微弱信號的目的。

4. 熒光光譜儀中的波長準確度和波長重復性

波長準確度，是指波長的實際測定值與理論值(真值)的差。熒光光譜儀的波長準確度是很重要的技術指標，特別是對不同儀器的測定結果進行比較時，波長準確度尤其重要。例如，要對比兩臺熒光光譜儀對同一樣品的分析測試結果，如果儀器的波長準確度不好，就無法進行比較或比較不出正確的結果。針對同一物質，在不同波長測試同一物質時，用于不同波長時的熒光性質不同，就會有不同的靈敏度，即使同一樣品，測試的數據也會不同。用一臺熒光光譜儀做定量分析時，若儀器的波長準確度不好，也會因儀器的波長誤差，而產生很大的分析誤差。波長準確度對國家的計量法執法非常重要。

波長重復性與波長準確度一樣重要。如果一臺熒光光譜儀的波長重復性不好，就等于每次分析測試時所用的波長都是不同的，不可能得到可靠的分析結果。因此，一臺儀器的波長重復性不好，就無法滿足使用要求。

5. 熒光光譜儀中的信噪比(S/N)

熒光光譜儀中常用水的拉曼作信噪比測試，這是比較不同儀器之間靈敏度的一個好方法。雖然有很多有效的方法可以獲得信噪比數據，但是給出的數值卻不同。為了進行對比，不僅要知道怎么測量水拉曼S/N值，還要知道怎么處理數據。

一般水的拉曼S/N測試方法是把體系的靈敏度(信號存在)和體系噪音(信號不存在)的數據同時獲取并進行比較，顯示了儀器的綜合性能。

對于S/N值的處理，一種是將其定義為水拉曼峰信號和背景信號的差值和背景信號平方根的比值(Peak-Peak方式)：

另一種是峰信號和背景信號的差值除以在背景信號上噪音的有效值(RMS信噪比方式)，有效值的取值可以是該點處動態掃描測量值除以5：

6. 熒光光譜儀的靈敏度影響因素

光源、檢測器暗電流，光譜儀設計造成的光學噪聲等因素都會影響靈敏度。

7. 熒光光譜儀的選擇

目前，熒光光譜儀根據特定的應用領域都附加有不同的特長。可以從靈敏度、光譜采集速度、模塊化、自動化、多功能性、獨特性、實際環境性能，以及升級需求等方面考慮選擇合適的熒光光譜儀。當然，也可以聯系生產廠商，提出應用需求，進行個性化定制。

二、熒光分析新技術

常規的熒光分析技術主要是直接或間接對無機化合物、有機化合物等進行定性和定量分析，因其高靈敏度和選擇性，得到了較為廣泛的應用。然而，在實際情況中由于分析物質的復雜性、所處環境的多樣性等，常規的熒光分析法收到了極大限制。許多新型的熒光技術，例如同步熒光分析、偏振熒光分析、三維熒光分析、時間分辨熒光分析、低溫熒光分析、單分子熒光分析、熒光免疫分析等，得到了迅速發展，在特定的領域顯示出了更高的靈敏度和更強大的功能。下面選擇幾種進行簡單介紹：

1. 同步熒光分析

同步熒光分析由Lloyd首先提出，它與常用熒光測定最大的區別是同時掃描激發和發射兩個單色器波長，由測得的熒光強度信號與對應的激發波長(或發射波長)構成光譜圖，即同步熒光光譜。按光譜掃描方式的不同，同步熒光分析可以分為恒(固定)波長法、恒能量法、可變角法和恒基體法。同步熒光分析具有光譜簡單，譜帶窄、分辨率高、光譜重疊少等優點，可提高選擇性，減少散射光等的影響，非常適合多組分混合物的分析，在環境、藥物、臨床、化工等領域應用廣泛。

圖2 某池塘水樣的恒波長同步熒光光譜

2. 偏振熒光分析

任何物質都處于不斷運動中，液體環境中的熒光分子也不例外。因此當受到偏振光激發時，熒光分子的運動狀態(如旋轉或翻轉)、熒光分子與其他因子相互作用(如相互結合或排斥)、其所處環境的性質(如溶液的黏度、溫度_等因素都可能對熒光分子受激發后發出的偏振光的性質產生影響。對此進行分析比較，就可能揭開物質活動的內在規律，達到研究目的。熒光體的熒光偏振與熒光各向異性值的測定，能夠提供與熒光體在激發態壽命期間動力學相關的信息，因此熒光偏振技術被廣泛應用于研究分子間的作用，例如蛋白質與核酸、抗原與抗體、蛋白質與多肽的結合作用等。

熒光偏振技術比研究蛋白質與核酸結合的傳統方法具有更多優勢(特別是不生成有害的放射性廢物)，并且檢測限更低，可達到亞納摩爾級范圍。此外，熒光偏振是真正均相的，允許實時監測(動力學監測)，對濃度變化不敏感，是均相檢測形式的最佳解決方案。

圖3 不同體積比全血溶液的熒光偏振光譜

3. 三維熒光分析

三維熒光光譜是近幾十年中發展起來的一種新熒光技術。普通熒光分析所得的光譜是二維譜圖，包括固定激發波長而掃描發射波長所獲得的發射光譜，和固定發射波長而掃描激發波長所獲得的激發光譜。但是實際上熒光強度應該是激發和發射這兩個波長變量的函數。描述熒光強度同時隨激發和發射波長變化的關系譜圖，就是三維熒光光譜。它可以提供比常規熒光光譜和同步熒光光譜更為完整的光譜信息，是很有價值的光譜指紋技術。在一個多組分體系的三維熒光光譜中，每種組分有獨立吸收和發射的特定光譜區，可以通過一次掃描便有可能檢測體系中的全部組分。

三維熒光光譜可以作為光譜指紋技術在環境監測(溶解有機質的分布等)、臨床化學(根據癌細胞熒光代謝產物的檢測，區分癌與非癌細胞等)以及細菌鑒別等領域應用；也可用于光化學反應監測、多組分混合物的定性和定量分析等。

圖4 三峽水庫中溶解有機質的三維熒光光譜圖

4. 時間分辨熒光分析

由于不同分子的熒光壽命不同，可在激發與檢測之間延緩一段時間，使具有不同熒光壽命的物質得以分別檢測，即時間分辨熒光分析。采用帶時間延遲設備的脈沖光源和帶有門控時間電路的檢測器件，可以在固定延遲時間后和門控寬度內得到時間分辨熒光光譜。選擇合適的延遲時間，可以把待測組分的熒光和其他組分或雜質的熒光以及儀器的噪聲分開不受干擾。采用激光光源可以獲得皮秒(ps)級的脈沖寬度，可用于測定大多數熒光物質的壽命，非常有助于生物大分子和基團作用的研究。該技術與熒光免疫分析結合形成了時間分辨熒光免疫分析法。

5. 低溫熒光分析

通常熒光分析都在室溫下進行，熒光光譜為帶光譜，由于各種變寬因素，譜帶往往較寬。自然界有許多有機化合物，其化學結構頗為接近，而且各存在著多種同分異構體和衍生物，它們的光譜往往相互重疊，難以鑒別表征以及定量測定。環境因素對分子熒光會產生顯著的影響，溫度是其中一個主要因素。隨著溫度的降低，介質黏度增大，熒光分子量子產率和熒光強度將增大。因此，在低溫以及特殊條件下，熒光物質就能給出尖銳的熒光光譜(“準線性光譜”)，這就有可能對樣品中所含熒光體進行“指紋識別”，甚至有可能對混合物中某些特定組分進行定量測定。

低溫熒光分析法基本可以分為四種類型：冷凍溶液Shpol’skii熒光法、蒸氣相基體隔離熒光法、基體隔離Shpol’skii熒光法、有機玻璃中熒光窄線法。低溫熒光分析可用于多環芳烴及衍生物的鑒別與定量、DNA加合物的分析等。

圖5 羊茅草葉綠素的常溫和液氮低溫下的熒光光譜

6. 單分子熒光檢測

單分子檢測被稱為分析化學的極限，近年來取得了重要進展。其中，單分子熒光分析是實現單分子檢測最靈敏的光分析技術。單分子熒光檢測的關鍵在于確保被照射的體積中只有一個分子與激光發生作用以及消除雜質熒光的背景干擾。通常采用高效濾光片，利用共焦、近場合消失波激發，可以達到此目的。單分子熒光檢測可提供單分子水平上生物分子反應的動力學信息，分子構象以及構象隨時間的變化，因此尤其在生命科學領域中具有廣闊的應用前景，為生命科學提供了新的研究手段。

7. 熒光免疫分析

免疫分析是基于蛋白抗原和抗體之間、或者小分子半抗原與抗體之間的特異反應的分析方法，是生物分析化學的重要內容之一。其中，用熒光物質作為標記的免疫分析即為熒光免疫分析。作為熒光標記物，應具有高的熒光強度，其發射的熒光與背景熒光有明顯區別；它與抗原或抗體的結合不破壞其免疫活性，標記過程要簡單、快速；水溶性好；所形成的免疫復合物耐儲存。常用的熒光物質有熒光素、異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明、四甲基異硫氰基熒光素等。熒光免疫分析主要應用于生物醫學領域，并向著超高靈敏度和操作自動化的方向發展。

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本文由材料人編輯部納米學術組Roay供稿，材料牛編輯整理。

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