程義云ACS Nano：以樹形高分子作為模板合成可有效滅活腫瘤的超小型、多功能化光熱劑

【摘要】

超小型多功能納米粒子用于光熱癌癥治療非常有前景，但這些納米顆粒的合成仍然存在問題。最近，華東師范大學程義云教授等人使用樹形聚合物作為模板合成超小光熱劑，并使用多功能團改性處理。

樹狀大分子封裝納米粒子（包括硫化銅、鉑和一個具有5nm尺寸的鈀納米顆粒）顯示出優異的光熱性能。利用TAT或RGD多肽對其進行改性促進細胞攝取能力和實現腫瘤靶向給藥。使用熒光探針修飾以實現實時成像和跟蹤粒子分布。該研究表明RGD修飾的DENPs在近紅外線照射下能有效地抑制腫瘤生長。

【解讀】

光熱治療（PTT）是一種很有前途的癌癥治療模式。為了進行高效的PTT，在過去十年中已開發出多種光熱劑（PAs），包括金屬納米粒子、碳基材料、半導體納米顆粒和有納米結構的聚合物。這些PAs均表現出優良的光熱效應和徹底的滅活腫瘤能力，但由于顆粒尺寸相對較大、多功能化難以實現等問題，它們很少被用于臨床。

顆粒大小顯著影響了PAs在體內的藥物學行為。PAs在一維上的尺寸一般大于40nm，難以深入腫瘤組織且難以被清除出體外，從而降低了治療效果并增加了潛在的毒性。但這個問題可以通過減小粒徑來解決。

據證實，小于10nm的納米顆粒可以滲透到腫瘤的更深區域，與較大粒徑尺寸的顆粒相比，更容易有效地被腫瘤細胞內化，也可以快速清理出體內。同時，超小的體積也使它們能夠逃脫網狀內皮系統的捕獲（例如，肝，脾），以提高它們在腫瘤細胞中的積累。

多功能化賦予PAs很多附加功能，包括診斷、成像、靶向給藥、跟蹤粒子的藥物學行為和評估治療效果。鑒于上述優勢，多功能納米粒子在個性化治療中很有發展前景。

然而，高質量多功能化仍是一個巨大的挑戰。多功能意味著附加成本增大和多合成步驟增多，特別是對于超小納米顆粒，在它們的表面很難排列不同的功能團。因此，合成的多功能納米粒子可能具有不理想的藥物動力學行為并在體內引起嚴重的不良反應。

樹形聚合物具有良好的形狀尺寸、中空的內部和高密度分布的表面功能團，使其可作為模板合成具有高單分散性和穩定性的超小納米顆粒（通常<5nm）。本研究首先使用樹形聚合物合成超小的光熱劑（UPAs），包括硫化銅（CuS）、鉑（Pt）和鈀（Pd）納米顆粒，然后用多功能基團改性它們。

樹形大分子封裝鉑納米粒子（DEPt）后具有優異的光熱效應和良好的生物相容性，成為性能最優的UPA。DEPt進一步用不同腫瘤靶向肽修飾（即反式轉錄激活因子（TAT）和環狀精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽），分別得到TAT-DEPt和RGD-DEPt。

使用熒光探針追蹤了細胞內TAT-DEPt和RGD-DEPt的傳遞，并在近紅外波段照射下（NIR）對它們的體外細胞殺傷功效進行了測定。深入研究它們的腫瘤靶向效率和滅活腫瘤的能力。

【制備方法】

1. G5-NH2聚酞胺-胺型樹形高聚物的合成

將G5-NH2樹形高聚物（200mg，0.007mmol）溶解于3ml無水甲醇，再加入三乙胺（127μL，0.911mmol）和乙酸酐（69μL，0.728mmol）。將該混合物在室溫下攪拌48小時，然后轉移到透析袋中，用去離子水透析10次。

2. 樹形封裝金屬納米粒子的合成

DECuS是通過共沉淀法制備的。首先，將0.354ml的CuCl2（100mM）加入到1.700mL的G5-NH2-AC100（0.163mmol）水溶液中，在室溫磁性攪拌條件下逐滴加入0.884ml的NaHS（80mM），隨后顏色立即從淺藍色變為深褐色。

30min后，將反應溶液轉移到油浴中并在90℃加熱15分鐘。最后，得到暗綠色溶液。在室溫下冷卻后，將反應溶液轉移到透析袋中用去離子水透析。收集最終產物并在4℃下保存。

標準的DEPt合成步驟是：使用磁力攪拌，在0.150mLG5-NH2-AC100水溶液（0.573mM）中加入0.553Ml的K2PtCl6（20 mM）。 24小時后，在反應溶液中加入0.553mL的NaBH4（200 mM）溶液。2h后，將反應溶液轉移到透析袋，并用去離子水透析。收集最終產物并在4℃下保存。

3. TAT或RGD修飾的樹形聚合物的合成

G5-NH2AC100（37.00mg，1.117μmol）分散在3.0mL含有3mM EDTA·2Na溶液（pH 7.2）的PBS緩沖液中。將溶解于DMSO溶液中的SMCC（2.24mg，7μmol）加入上述溶液中，然后將反應溶液在室溫下攪拌24h。

將TAT（13.93mg，8μmol）或RGD（4.85mg，8μmol）加入到反應溶液中，并將混合物在室溫下攪拌24h。將該溶液裝入透析袋用去離子水透析以除去游離的肽。

4. TAT樹形RBITC和RGD樹形RBITC的制備

通過在TAT-樹形聚合物溶液中（1.10μM）加入RBITC（5.50μM）制備TAT-樹形大分子RBITC。該混合物在室溫，黑暗環境中攪拌24h。未反應的RBITC通過多次去離子水透析除去。RGD-樹形大分子-RBITC通過相同方法制備。

5. TAT-DEPt和RGD-DEPt的制備

TAT-DEPt 和 RGD-DEPt的制備與DEPt的合成方法相似。將0.553mLK2PtCl6（20mM）加入到0.150mLTAT-樹狀物或RGD-樹狀物（0.573mM）中。

24h后，將0.553mL的NaBH4（200 mM）溶液加入到該反應溶液攪拌2h。然后將反應溶液轉移到一個透析袋，并用去離子水透析。收集最終產物并在4℃下保存。。

6. RGD-DEPt-Cy5.5的制備

通過在去離子水中混合0.005mLCy5.5 N-羥基琥珀酰亞胺酯(0.7mM)和0.15mL RGD-DEPT（0.7 mM），在黑暗環境下反應24小時獲得RGD-DEPT-Cy5.5。

【結果簡析】

1. 表征

圖1 ?多功能UPAs的制備示意圖

乙酰化的樹形大分子先封裝納米粒子（包括硫化銅、鉑和鈀納米顆粒），再表面改性處理，最終得到具有超小尺寸、多功能且高穩定性的UPAs。

圖2 ?DECuS、DEPt、DEPd的TEM圖像

該插圖顯示單DENP的高分辨透射電子顯微鏡圖像。用共沉淀法制備了樹狀大分子封裝納米CuO（DECuS）。

該透射電子顯微鏡（TEM）圖像示出DECuS有4.5±3.0nm的平均超小尺寸，0.33nm的晶格條紋，這與六角CuS的（102）面一致。DEPt有1.4±0.3nm的超小型尺寸，DEPd的尺寸為1.5±0.5nm。

高分辨透射電子顯微鏡圖像顯示，DEPt和DEPd的晶格條紋分別為0.22和0.21nm。

2. DENPs的光熱效率

圖3 ?懸浮于去離子水（300μM，1mL）中的DENPs的溫度變化

去離子水和樹形聚合物溶液用作對照。通過暴露在NIR光下，DECuS、DEPt和DEPd懸浮物的溫度迅速提高到一個很高值，分別為45.6、47.0和43.8℃，而去離子水和樹形聚合物溶液顯示增強最小。結果表明，DENPs能高效地將NIR光轉化為熱能。

3. 細胞毒性

NIH3T3和PC-9細胞接種在96孔板中，實驗前一天，每個孔的密度為10000個細胞。細胞用PBS洗滌一次，然后在37℃下與DENPs一起培養在濃度范圍為0-400μM的孔板中24小時。（相當于樹形聚合物的濃度范圍是0-3.906μM）

圖4 ?三種DENPs在NIH3T3細胞中的細胞毒性

通過對NIH3T3的正常細胞系和PC-9的癌細胞系使用標準的3-（4,5-二甲基吡啶-2-基）-2,5-二苯基溴化物（MTT）法對DENPs的細胞毒性作用進行評估。結果表明，DEPt和DEPd在0-400μm的濃度范圍內對兩種細胞系的毒性可忽略，而DECuS在高濃度時是有毒的。

4. 使用DEPt光熱殺傷腫瘤細胞

PC-9細胞接種在96孔板中，實驗前一天，每個孔的密度為10000個細胞。將細胞與DEPt在37℃，200μM的濃度下培育4小時（相當于樹形聚合物的濃度1.953μM，光密度為808nm（OD808）=0.225），然后在功率密度為6.4 W·cm?2的808nm的近紅外激光照射10分鐘。

此外，激光功率密度和照射時間是變化的，以評估癌癥殺傷效率。 NIR治療后，再將細胞在37℃培養2小時，然后用標準MTT法進行分析。 為了使用AO / EB雙重染色法，將細胞在近紅外輻射后用冷PBS洗滌兩次，然后用AO（5μg/mL）和EB（5μg/mL）染色處理3分鐘。在此之后，將細胞再用冷PBS洗滌兩次并用熒光顯微鏡觀察。

5. 體外細胞攝取TAT樹形RBITC和RGD樹形RBITC

圖5 TAT肽增強細胞攝取DEPt。 TAT媒介細胞攝取DEPt示意圖

圖 6 RGD肽增強部的細胞攝取DEPt RGD媒介細胞攝取DEPt的示意圖

TAT肽可以穿透細胞膜，促進細胞對不同藥物的攝取，在G5-NH2聚酞胺-胺型樹形高聚物上修改2.5 TAT肽的平均數目，熒光探針和羅丹明B異硫氰酸酯（BITC）被進一步修飾在TAT-樹形聚合物上，用于原位監控（TAT-樹狀RBITC）。

圖 7 ?RBITC發出紅色的熒光。肌動蛋白絲被鬼筆環肽-FITC（綠色）染色，細胞核被DAPI（藍色）染色

NIH3T3細胞和PC-9細胞分別用TAT-樹狀RBITC和樹形大分子RBITC處理。經過4小時的溫育，僅TAT-樹狀RBITC被被兩種細胞更有效地吸收。

6. 通過ICP-MS（電感耦合等離子體質譜）分析體外細胞攝取TAT-DEPt和 RGD-DEPt

圖 8 ?測定PC-9細胞中Pt的含量

用樹形TAT制備TAT-DEPt，它有類似于DEPt的大小和光熱效應。PC-9細胞用TAT-DEPt和DEPt處理，細胞內的Pt含量通過電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）測定。結果顯示，被TAT-DEPt處理的細胞中鉑含量比被DEPt處理的細胞的高得多。

7. 使用TAT-DEPt或RGD-DEPt光熱殺死腫瘤細胞

圖 9 PC-9細胞在NIR照射后AO / EB雙重染色結果

光熱殺傷實驗表明，在近紅外照射前去除自由的TAT-DEPt。用TAT-DEPt處理的PC-9細胞在照射區域全部被殺死（如上圖右，有白色虛線圓標志），而用DEPt處理的細胞表現出可以忽略不計的細胞死亡（如上圖，左）。

這些研究證實了TAT肽可以提高細胞攝取DEPt的能力，導致體外更有效的光熱殺死癌細胞。

8. 體內光熱滅活腫瘤

圖 10 ? ?PTT治療后切除腫瘤，腫瘤的形貌和重量

腫瘤組織中RGD-DEPT組（RGD+）鉑的含量均顯著增加，但在肝和脾12h和24h兩個時間點處RGD-DEPT組（RGD+）鉑的含量與DEPT組（RGD-）相比降低了。上述分析證明RGD可以有效地提高靶向遞送DEPt到腫瘤的能力。

圖 11 ?通過原位末端標記測定治療后凋亡的腫瘤細胞（紅色）

上圖表明，RGD-DEPT可有效積累在腫瘤并實現高效的PTT。

【總結】

DENPs衍生的UPAs包括DECuS、DEPt和DEPd，具有尺寸超小，單分散性好、穩定性和光熱轉換效率高等優點。得益于樹形聚合物表面上的高密度的功能團，DENPs可以被不同的功能團修飾，如細胞穿膜肽、腫瘤靶向肽和熒光探針，它們的數量和位置可控制。

程義云教授等人的研究將樹狀大分子與超小型納米粒子合成和精確表面改性的優點相結合，提供了為剪裁PTTs制備多樣化UPAs的一個簡易路線。

【程義云教授簡介】

2004年本科畢業于中國科技大學高分子科學與工程專業，之后開始在中國科學技術大學進行碩博連讀，并于2008年獲得中國科學技術大學結構生物學專業理學博士學位。之后在美國圣路易斯華盛頓大學（Washington University in St. Louis) 做博士后。2010年受聘于華東師范大學生命科學學院生物醫學工程專業教授，同年8月被聘為博士生導師。

一直致力于樹枝形分子等納米生物材料的研究工作?已經在Nature Materials? Chemical Society Reviews, Journal of the American Chemical Society? Journal of Physical Chemistry B等國際知名刊物發表第一作者/通訊作者SCI論文30多篇?論文影響因子總和達160? 被制藥科學和藥物化學領域知名刊物Chemical Society Reviews, Frontiers in Bioscience? Journal of Pharmaceutical Sciences? European Journal of Medicinal Chemistry等邀請撰寫專題綜述6篇? 所發表第一/通訊作者論文已有7篇（次）被雜志選為出版當年、當季度的熱門或引用次數最多的文章。

【備注】

該研究成果近期發表在ACS Nano (IF: 12.881)上，文獻鏈接：Dendrimer-Templated Ultrasmall and Multifunctional Photothermal Agents for Efficient Tumor Ablation

本文由材料人生物材料學習小組年輕的瘋狂者供稿，材料牛編輯整理。

歡迎加入材料人生物材料學習小組，一起探討生物材料的專業問題，關注生物材料的最新動態。加入方式：添加材料人生物材料交流群（124806506），私信管理員“陳昭銘（QQ: 1982342885）”報名。

歡迎各大課題組到材料人宣傳科技成果并對文獻進行深入解讀，投稿郵箱tougao@cailiaoren.com