丹麥技術大學ACS Nano : 脂質體負載多種生物制劑，靶向刺激哺乳動物雷帕霉素信號通路保護視網膜神經

【引言】

視神經病（如青光眼等）是不可逆失明的主要原因，視神經病變的常見原因包括視神經（ON）和視網膜中RGC軸突的丟失和RGC的死亡。之前研究表明，哺乳動物的雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路激動劑在視神經損傷的動物模型中能促進軸突再生和RGC存活。然而，在開發利用細胞生長和組織重塑的治療方法過程中仍存在許多困難與挑戰。 ?

?對于臨床轉化應用，結合刺激mTOR通路的生物制劑用于RGC 神經保護需要進行修飾，以在對細胞途徑調節（即，啟動子，抑制劑，誘導劑，激動劑和拮抗劑）遞送，釋放，清除和駐留時間的有更好控制。納米載體能夠（例如，微載體，脂質體等）遞送多種細胞途徑調節劑同時控制調節劑釋放，保護敏感貨物免于降解，減少清除機制的影響并改善生物屏障對貨物的吸收。脂質體含有膽固醇的磷脂囊泡是視網膜疾病的一種有利的傳遞系統，能負載疏水和親水分子，在眼內（玻璃體內或視網膜下）注射后延長眼內保留，保護藥物延緩變質，并有臨床批準的歷史。載有多種細胞通路生物制劑的脂質體以前沒有被報道用于CNS 神經保護和再生。

【成果簡介】

近日，丹麥技術大學的?Andrew J. Urquhart課題組構建了一種負載多種刺激mTOR通路的生物制劑的脂質體，旨在增強視網膜損傷后的神經保護作用。該研究發表于ACS Nano (DOI:?10.1021/acsnano.8b00596)。該研究中，脂質體負載有睫狀神經營養因子，胰島素樣生長因子1，脂肽N-片段骨橋蛋白模擬物，以及用于ATP結構域或c-末端尾部的脂肽磷酸酶張力同源物抑制劑。裝載有多種細胞途徑調節劑的脂質體，具有將調節劑同時遞送至細胞微環境的優點，促進對單細胞或多細胞途徑的協同作用。此外，只需要非常低的濃度的信號通路調節劑通常就能達到非常有效治療效果。這減少了對高分子藥物負載的需要，并且最大化可用于將一系列治療性小分子：肽和蛋白質包裝到脂質體中的空間。

作者首先以棕櫚酰（C₁₆）綴合的肽（即脂肽）C₁₆?-OPP?，C₁₆?-PAP2和C₁₆?-PAP4為原料合成了三種脂質體LipA、LipB和LipC（圖1 A)，并用HPLC進行了純化，然后對脂質體的粒徑、zata電位等進行了表征（圖1 B、C)，以確保載藥的脂質體能具有低毒性以及能在眼球玻璃體能順利擴散。

圖1 原理示意圖及脂質體表征

（來源：ACS Nano）

接下來作者測定了視網膜類器官（小鼠胚胎干細胞（MES）分化的視網膜細胞組織體）對于脂質體的攝取和相關藥代動力學結果。結果顯示LipA比LipB、LipC有更好的攝取效果(22.6 %)（圖2 A）；為了確定脂質體攝取是否與特定細胞類型相關，作者測定了五種視網膜類器官細胞類型的的攝取情況，發現并無明顯差異存在（圖2 B）。

圖2 視網膜類器官中脂質體的攝取

（來源：ACS Nano）

為了探索載藥脂質體對于視網膜功能的影響，作者用N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）誘導小鼠視網膜神經節細胞（Retinal?ganglion?cell：RGC）死亡進行造模，然后分別向眼球玻璃體注射了三種脂質體，4周后通過視網膜電圖（ERG）評估小鼠的視網膜功能，證實20mM濃度的玻璃體內注射不會導致光感受器損傷，Lip A對中間神經元和雙極神經元細胞具有顯著的保護作用，但對RGC具有混合作用。相反，Lip B對中間神經元和雙極細胞沒有顯示出顯著的保護作用，但表明對RGC具有保護作用。

圖3.?空白與造模小鼠的視網膜電圖振幅值

（來源：ACS Nano）

為了評估單次玻璃體內注射三種載藥脂質體對NMDA誘導RGC死亡后宿主RGC存活的影響，作者對視網膜整體支架進行了RBPMS染色并在共聚焦顯微鏡上成像（圖4?A B C）。通過計算圖中RGC細胞存活數量與健康組進行對照（圖4?D），顯示Lip C不具有神經保護作用，Lip A或Lip B治療不能完全防止RGC損傷。

圖4.?NMDA誘導小鼠視網膜損傷后注射三種脂質體對于?RGC的保護作用

（來源：ACS Nano）

為了進一步加強治對于RGC的治療效果，作者選擇了注射脂質體與RGC移植相結合的方法，移植后4周通過視網膜電生理功能和供體細胞存活評估療效。結果表明（圖5?A B C），脂質體A（Lip A）以改善宿主STR振幅的方式支持RGC移植, 細胞生長信號通路的激活和其他視網膜細胞類型（例如，無長突，雙極等）的保護可能對移植RGC恢復宿主組織功能至關重要。

圖5.?經過載藥脂質體和移植RGC（tRGC）治療的暗適應小鼠的視網膜電圖振幅值。

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（來源：ACS Nano）

此外，作者還通過RBPMS染色和共聚焦顯微鏡評估組合治療對宿主RGC存活的影響（圖6?A B C D），結果顯示Lip A和Lip C組中觀察到移植RGC的存活，且與先前關于移植細胞的報道相比存活時間更長，損傷后移植細胞存活和宿主RGC的死亡情況而得到改善。

圖6.移植RGC和宿主小鼠的存活情況以及移植RGC的共聚焦圖

（來源：ACS Nano）

以上這些結果說明，單次脂質體玻璃體內給藥能夠降低RGC死亡和視網膜電生理功能的喪失。此外，將脂質體與誘導的多能干細胞衍生的RGC移植相結合，能改善小鼠的眼球電生理學。這些結果顯示,攜帶多種以上信號傳導通路調節劑的脂質體可促進神經保護和改善移植后電生理學狀況。

該項研究為視神經病的治療提供了新的思路和方法。下一步，該團隊將進一步探索該方法的劑量動力學（例如，調節劑濃度，調節劑組合，注射次數，注射之間的時間等），有望將此技術轉化為臨床可行的視神經病治療方法。

論文地址：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.8b00596

本文由黃浠桐供稿。

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