Itamar Willner教授Acc. Chem. Res.最新綜述：基于DNA的刺激響應水凝膠：從基本原理到應用

【引言】

核酸的堿基序列將結構和功能信息引入到DNA生物基聚合物中。如金屬離子、pH、光或添加的核酸燃料鏈等外部刺激可以提供觸發條件來可逆轉換核酸結構，如金屬離子橋接雙鏈體、單鏈、三鏈核酸、G-四鏈體或寡核苷酸的程序化雙鏈雜交體。信號觸發的寡核苷酸結構已廣泛應用于開發可轉換的DNA納米結構和DNA機器，并且這些刺激響應的組件為快速發展的DNA納米技術領域提供了功能支架。刺激響應水凝膠在遭受信號觸發時的凝膠-溶膠轉變或信號控制的剛性變化的特性使得其可以作為功能性基質應用于藥物輸送、可轉換機械性能的材料、致動器、傳感和信息處理智能材料等領域。刺激響應寡核苷酸與水凝膠的結合提供了多種手段來開發編碼在核酸序列中的功能性信息，從而產生具有可轉換結構和物理化學性質的刺激響應水凝膠。

近日，來自以色列耶路撒冷希伯來大學的Itamar Willner教授(通訊作者)等人在Accounts of Chemical Research期刊上發表了題為“Stimuli-Responsive DNA-Based Hydrogels: From Basic Principles to Applications”的綜述，詳細介紹了作者實驗室對刺激響應性DNA水凝膠的研究的最新進展。除了使用核酸作為通用的觸發器“工具箱”來組裝刺激響應水凝膠作為新功能材料外，還介紹了這些系統的新型應用。

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綜述總覽圖

1.簡介

DNA堿基序列除了作為在遺傳信息載體和合成蛋白質的翻譯代碼中起到關鍵作用外，通過過去二十年的研究，DNA作為功能材料在化學、物理學、計算機科學和醫學方面有了長足的進展。DNA中的堿基序列將大量結構和功能信息編碼進入生物聚合物。除了由互補堿基對形成的Watson-Crick雙鏈螺旋之外，還有各種其它DNA結構，例如pH驅動的C-G?C⁺或T-A?T三鏈體。這些不同的結構可以通過它們各自的反向信號解離。除了這些結構模體外，DNA還有進一步序列命名的功能。寡核苷酸的序列指定的結構和功能性質使其作為功能材料應用于程序化DNA結構的組裝，DNA開關和DNA機器等。現有研究已經證明了DNA和DNA雜化系統的結構和功能特性在傳感，藥物遞送和納米裝置制造等方面的應用。

水凝膠代表由高度交聯的親水性聚合物網絡吸收大量水溶脹后組成的一類材料。許多水凝膠由天然或合成的交聯基質組成。刺激響應性水凝膠代表了該領域中的一個重要分類；不同的外部觸發因素如pH、光、溫度、氧化還原反應或化學觸發已經用于誘導可逆的水凝膠-溶液或水凝膠-固體的轉變。刺激響應水凝膠在傳感、材料分離、可控釋放和催化等方面具有不同的應用。用于可逆切換DNA單元結構和寡核苷酸獨特識別功能的觸發器表明刺激響應性DNA單元交聯聚合物基質可以作為設計基于DNA的刺激響應水凝膠的通用手段。

2.刺激響應DNA水凝膠的制備

兩種通用方法用于組裝刺激響應性DNA水凝膠。第一種策略是通過多齒DNA單元交聯形成全DNA水凝膠，可以包括在交聯網絡刺激響應性組分中。盡管已經報道了全DNA水凝膠的一些應用，例如，水凝膠亞單位通過熒光核酸穩定的Ag⁺納米簇的交聯，但是由全DNA作為功能材料組成的刺激響應水凝膠的效益由于核酸成分的成本而受到限制。解決與全DNA刺激響應核酸基水凝膠相關不足的第二種方法主要是將功能性核酸與聚合物鏈如聚丙烯酰胺相連接，如圖1所示。根據這種方法，在合適觸發劑的存在下，交聯功能性核酸修飾的聚合物鏈形成刺激響應水凝膠。水凝膠系統在受到反向觸發時又會使得核酸交聯單元解離得到聚合物溶液。圖1主要展示了刺激響應性丙烯酰胺-DNA水凝膠的幾個例子。圖1A所示，在第一個例子中，丙烯酰胺鏈用丙烯酸核酸修飾，顯示出自身互補性和內部C-C不匹配。盡管自互補堿基的數量不足以產生穩定的交聯水凝膠結構，但是通過添加Ag⁺形成C-Ag⁺-C橋，協同穩定了交聯單元。形成的水凝膠表現出高儲能模量和低損耗模量。在水凝膠中加入半胱胺除去交聯單元的Ag⁺離子，導致水凝膠解離成聚合物溶液，該循環可通過加入適當的觸發劑而重復(圖1B)。

G-四鏈體/18-冠-6-醚刺激響應的可逆丙烯酰胺水凝膠系統的研究呈現在圖1C中。使用丙烯酰胺共聚物鏈，P_A和富含G的丙烯酰胺基核酸官能化的丙烯酰胺鏈組裝形成可轉換的水凝膠基質。當K⁺存在時，改性的聚合物鏈自組裝成K⁺穩定的G四鏈體交聯的水凝膠。用18-冠-6醚處理水凝膠消除G-四鏈體單元中的K⁺離子，導致水凝膠解離。

圖1D描述了通過H₂O₂實現ABTS^2?開/關可調節氧化，形成血紅素/K⁺穩定的G-四鏈體交聯的水凝膠(開)和其在18-冠-6-醚存在下的解離(關)。類似地，使用光異構化偶氮苯單元制備可以得到光響應性DNA基水凝膠，如圖1E所示。通過低含量雙丙烯酰胺交聯劑交聯丙烯酰胺聚合物鏈，P_B和P_C得到低剛度的丙烯酰胺水凝膠。聚合物P_B用順式偶氮苯單元官能化的核酸系鏈修飾，聚合物鏈P_C包括互補系鏈。通過將反式偶氮苯單元逆向光異構化為順式異構體狀態(λ= 365nm)，雙鏈體橋連單元分離產生低剛性的水凝膠，同時，系統可以再次在較高剛度(較低體積)和較低剛度(較高體積)之間循環(圖1F)。

圖1 水凝膠的制備及刺激響應

(A) 聚丙烯酰胺/核酸刺激響應水凝膠的合成，在Ag⁺離子和半胱胺作為觸發劑的條件下實現循環水凝膠-溶液轉變
(B) ?Ag⁺離子/半胱胺觸發的丙烯酰胺水凝膠的流變表征
(C) 催化可切換的血紅素/G-四鏈體HRP-模擬DNAzyme水凝膠的合成
(D) 循環ON/OFF激活血紅素/G-四鏈體功能化水凝膠的催化功能
(E) 光誘導的可逆水凝膠-溶液的轉變
(F) 光響應DNA基水凝膠體積變化

3.刺激響應DNA水凝膠應用

3.1 熱敏性DNA基刺激響應水凝膠

通過兩個信號觸發基于刺激響應核酸的水凝膠的能力使得能夠在多個輸入和條件下控制可逆的水凝膠-溶膠轉變和刺激指定的體積轉變。聚(N-異丙基丙烯酰胺)，pNIPAM，在32^oC下可以實現可逆的水凝膠和固體過渡的熱敏性聚合物。與僅具有可逆的凝膠到固體轉變的共價交聯的pNIPAM水凝膠相反，DNA功能化pNIPAM可以在溶液-水凝膠-固態可逆轉變。如圖2A所示，使用富含丙烯酰胺胞嘧啶的系鏈官能化的NIPAM鏈。在pH=7.5時，聚合物以溶液狀態存在；系統酸化至pH = 5.2，富含胞嘧啶的系鏈構型成i-模體單元，交聯pNIPAM鏈形成水凝膠。通過中和系統酸性，可使i-模體交聯解離，變成溶液狀態，并且在pH=7.5和pH=5.2時系統的循環處理顯示溶液和水凝膠狀態之間的可逆過渡(圖2B)。將水凝膠基質加熱至45^oC將水凝膠轉變成收縮的固體，同時將固體冷卻至25^oC導致水凝膠溶脹恢復(圖2B)。相似的轉變通過Ag⁺離子交聯核酸功能化的pNIPAM共聚物鏈，誘導形成系鏈間的C-Ag⁺-C橋連雙聯體。所得水凝膠在加熱至45^oC時轉變為固體狀態，并在用半胱胺處理時解離為溶液狀態(圖2C)。

圖2 熱敏性DNA基刺激響應pNIPAM水凝膠的合成

3.2 藥物控釋

刺激響應性DNA水凝膠的進一步應用包括使用功能水凝膠作為傳感和控釋基質。此類系統的代表性實例包括通過聚合物鏈與核酸適體或金屬離子依賴性DNA酶/底物復合物交聯而產生的水凝膠，這些已經被用于感測蛋白質，例如凝血酶，或金屬離子。信號觸發水凝膠向溶液相的轉變也提供了釋放水凝膠負載分子的通用手段。水凝膠通過DNA酶觸發器的循環溶解用于釋放酶負載和激活酶級聯(圖3)。將三種酶，β-半乳糖苷酶(β-Gal)，葡萄糖氧化酶(GOx)和HRP裝載在由三種不同的金屬離子依賴性DNA酶/底物交聯的三種不同的刺激性丙烯酰胺DNA水凝膠中(圖3A)。β-Gal固定在由Zn²⁺依賴性DNA酶穩定的水凝膠中，GOx被Mg²⁺依賴性DNA酶固定，HRP被Cu²⁺依賴性DNA酶固定。在乳糖作為底物和ABTS^2-的存在下，并且在加入所有三種金屬離子Zn²⁺，Mg²⁺和Cu²⁺后，三個酶級聯被活化(圖3B)。得到的著色ABTS^-提供生物催化級聯的讀出信號(圖3C)。

圖3 通過三種不同水凝膠的金屬離子解離激活三酶催化級聯

3.3 形狀記憶系統

刺激響應性DNA水凝膠可以作為功能材料來定制形狀記憶系統。多種觸發器可逆重構核酸結構為設計形狀記憶DNA水凝膠基質提供了豐富的方法，如圖4A所示顯示了pH響應形狀記憶水凝膠的合成。將無定形聚合物溶液在三角形模具中調節至酸性pH(pH=5.0)，得到通過雙鏈體11/11和i-模體交聯10/10協同穩定的水凝膠。該水凝膠通過循環pH刺激可以實現成型水凝膠和無形狀準液態之間的可逆轉變(圖4B)。

通過這種刺激觸發形狀記憶DNA水凝膠的概念來發展通過其他刺激觸發的不同形狀記憶水凝膠，例如pH觸發的C-G?C⁺或T-A?T三重橋，K⁺穩定的G-四鏈體/Kryptofix [2.2.2]或Ag⁺穩定的C-Ag⁺-C-橋接/半胱胺。圖4C舉例說明了K⁺離子/冠醚觸發的形狀記憶水凝膠的組裝。如圖4D，通過G-四鏈體單元與冠醚的分離誘導定形和無定形狀態的循環轉變，而K⁺離子的再加成使G-四鏈體橋再生從而恢復成形水凝膠。形狀記憶DNA水凝膠的概念進一步擴展到組裝雜化形狀記憶水凝膠，允許定向觸發，目標在雜化水凝膠結構內的可逆轉變，橫跨定形水凝膠和無定形液體相。

圖4 pH響應形狀記憶丙烯酰胺-DNA水凝膠

(A) pH響應形狀記憶丙烯酰胺-DNA水凝膠的合成
(B) 循環pH誘導系統在三角形水凝膠和準液態無定形態間轉變
(C) 通過G-四鏈體和雙鏈橋接單元協同穩定的丙烯酰胺-DNA水凝膠的合成和形狀記憶性質
(D) 分別用K⁺和冠醚處理時，成形三角形水凝膠和無定形準液態之間循環轉變

上述這種組裝概念在圖5中通過三臂箭頭結構的組裝為例呈現。所有三個箭頭包括自互補雙鏈DNA橋14/14作為水凝膠橋連單元，使其成為從剛性水凝膠到無定形準液態的任何轉變的永久記憶。圖5B描繪了使用鏈24/25作為域間橋的邊緣交聯將三個箭頭結構在模具中的逐步組裝。將三個箭頭結構施加到相應的燃料/反燃料鏈以及適當的pH使得臂在成形和無形狀態之間循環變換，如圖5C所示。

圖5 水凝膠組裝及形態轉變

(A,B) 三個箭頭形狀的雜化水凝膠結構的組裝示意圖
(C) 在適當觸發的存在下，區域可控的凝膠-準液體轉變

基于DNA的形狀記憶水凝膠的概念通過設計由兩個正交觸發器觸發的形狀記憶水凝膠而得到進一步開發(圖6)。在這些系統中，成形的水凝膠通過兩個協同模體交聯。一個交聯元件包括自互補橋接器，并且第二交聯單元通過兩個不同的正交觸發器分離和恢復。圖6A描繪了由pH和Ag⁺離子作為正交觸發的形狀記憶水凝膠。通過循環使用pH或Ag⁺/半胱胺作為正交觸發，水凝膠在成形水凝膠和無定形準液態之間可逆轉化(圖6B)。相類似的系統使用Pb²⁺或Sr²⁺離子作為正交觸發器用于構建基于雙鏈體(永久記憶)和G-四鏈體作為穩定成形水凝膠結構的協同交聯單元的形狀記憶水凝膠(圖6C,D)。

圖6 使用兩個正交觸發器激活形狀記憶水凝膠，使其在成形水凝膠和準液態之間循環和可逆轉換

3.4 刺激響應水凝膠薄膜涂層

水凝膠在表面上的沉積，特別是刺激響應性水凝膠，可以促進水凝膠裝置的發展。雜交鏈式反應(HCR)過程作為在表面上組裝薄刺激響應水凝膠的通用方法而被廣泛使用。該反應包括使用啟動子核酸引發的兩個發夾H_A和H_B的交叉開放，其中啟動子打開H_A以產生用于打開H_B的單鏈toehold，并且繼而產生H_B-打開的產物包括打開發夾H_A的toehold區域。發夾結構的交叉開口被用于交聯核酸官能化的丙烯酰胺鏈，以在表面上產生刺激響應的水凝膠膜(圖7A)。由于橋連水凝膠包括游離的富含G的系鏈，這些鏈在K⁺離子的存在下組裝成G-四鏈體，其協同地穩定水凝膠，產生剛性的水凝膠。用18-冠醚-6醚處理膜從基質中除去K⁺離子，得到剛性降低的水凝膠膜。微壓痕實驗遵循水凝膠膜在剛性狀態和低剛性狀態之間循環過渡(圖7B)。血紅素與G-四鏈體單元的結合產生了用于還原H₂O₂的電催化單元，因此通過在電極表面上組裝血紅素/G-四鏈體官能化的水凝膠薄膜，以及隨后冠醚刺激血紅素/G-四鏈體的分離，證明了H₂O₂的循環開/關電催化還原(圖7C)。

圖7 水凝膠薄膜的制備及應用

(A) 使用HCR在Au涂覆的表面上組裝G-四聯體刺激響應性水凝膠薄膜
(B) 在冠醚存在下，通過K⁺穩定的G-四鏈體交聯水凝膠以及其解離實現水凝膠膜的剛性可控
(C) 通過血紅素/G-四鏈體刺激觸發控制H₂O₂電催化還原

3.5 水凝膠微膠囊

用刺激響應水凝膠基質涂覆表面可以得到用于觸發藥物釋放的刺激響應水凝膠微膠囊。微米級厚度的刺激響應丙烯酰胺-DNA水凝膠膜的沉積已經被用于合成基板負載的刺激性水凝膠微膠囊，以pH響應水凝膠微膠囊的制備進行舉例說明(圖8A)。負載CaCO₃微粒基板使用聚丙烯胺鹽酸鹽和聚丙烯酸層涂覆。水凝膠涂層通過發夾H_C/H_D的交叉開放和互補雙鏈體36/37形成的協同雙鏈橋穩定。鏈36被設計成包含在酸性條件(pH=5.0)下重構成能量穩定的i-模體的胞嘧啶系鏈(圖8B)。雙鏈體單元36/37的分離降低了水凝膠殼的剛度，導致微膠囊殼的滲透性增強以及基質中物質的釋放。圖8C描述了封裝在微膠囊中的化療藥物阿霉素在pH = 5.0的時間依賴性釋放。同時，作者發現刺激響應DNA交聯的丙烯酰胺微膠囊表現出幾種不同的性質：(i) 微膠囊的殼維持其儲層邊界，并且在適當刺激存在下，可以在剛性和準液態之間可逆轉換；(ii) 低分子量或大分子負載(例如酶)不會擴散穿過硬殼到本體溶液，而是自由滲透通過準液體殼。因此，刺激響應DNA基丙烯酰胺水凝膠微膠囊是對功能性微載體例如聚合物囊泡或微凝膠的一個補充。但是，與允許低分子量底物自由進出滲透和抑制大分子負載擴散的這些系統不同，刺激響應DNA基微膠囊表現出可控制滲透的開/關。這些特征代表了基于DNA的微凝膠在未來醫療應用具有其特有的優勢。

圖8 水凝膠微膠囊制備及應用

(A) 基板負載pH響應丙烯酰胺-DNA水凝膠微膠囊的合成
(B) 通過將水凝膠交聯元件之一重構成i-模體單元，實現pH誘導微膠囊殼流動性的增強，達到載體pH可切換釋放
(C) 在(a)pH=7.2和(b)pH=5.0時，pH響應微膠囊中阿霉素修飾的葡聚糖的時間依賴性釋放，以及不同pH值對熒光負荷釋放的影響

【結論與展望】

可轉換核酸結構的豐富的“工具箱”提供了大量手段來構建刺激響應水凝膠，通過可逆水凝膠-溶液相的轉換來組裝形狀記憶水凝膠，并設計具有可控剛性的水凝膠。這種刺激響應DNA基水凝膠可以作為功能基質在可控藥物輸送、傳感和信息儲存等方面具有不同應用。盡管在研究基于DNA的刺激響應水凝膠方面取得了大量進展，但仍然有許多挑戰亟待解決。例如，設計光或氧化還原反應觸發的性能可控水凝膠用于新的電催化或光催化材料。此外，納米材料(金屬或半導體納米粒子或納米棒)或碳材料(碳納米管/石墨烯)與刺激響應性水凝膠的結合可制備得到剛性可控的雜化基質，例如限制細胞生長的界面。另外，寡核苷酸通過堿基對互補，金屬離子或pH驅動橋接形成雙鏈體或三鏈體的固有性質提供了開發自愈合水凝膠的手段。最后，用于可控釋放(例如藥物，香料，食品添加劑)的刺激響應性水凝膠微膠囊的廣泛應用也是重要的發展方向。

文獻鏈接：Stimuli-Responsive DNA-Based Hydrogels: From Basic Principles to Applications(Acc. Chem. Res.,2017, DOI: 10.1021/acs.accounts.6b00542)

本文由材料人高分子材料組watermelon供稿，材料牛整理編輯。

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